Aislacion y Cultivo de protoplastos

Aislación y cultivo en suspensión de protoplastos de vetiver.
Materiales y métodos.
Material vegetal e iniciación del cultivo en suspensión celular.
Para este experimento fueron utilizadosgermoplasmas de Vetiveria zizainoides. La influorescencia fue esterilizada superficialmente por un remojo en alcohol etílico al 70% por 5 minutos, luego cortado en piezas pequeñas y transferidas a un mediosólido de Murashige-Skoog (MS) () suplementado con 15 uM 2.4-D. Después de tres semanas de cultivo los callos fueron transferidos a un medio MS sólido suplementado con 10uM 2,4-D. En este medio, seformaron embriones amarillos friables y compactos. Se seleccionaron sólo callos compactos y secuencialmente cultivados en medio basal N6 líquido suplementado con 10uM 2,4-d, 10mM de prolina y 20g/L desacarosa (pH 5.8) (Prasertsongskun, 2003). Los cultivos fueron crecidos en frascos erlenmeyer de 125mL, en un agitador giratorio con una agitación de 110 rpm, bajo un fotoperiodo de 16 horas, unaintensidad lumínica de 50uEm-2s-1 y una temperatura de 25 ±2°C. Los cultivos de células en suspensión de vetiver fueron estabilizados desde un callo dentro de 6 meses. Los cultivos celulares en suspensiónfueron transferido al mismo medio N6 y sub-cultivados semanalmente.
Aislación de protoplastos.
Los protoplastos fueron aislados desde un cultivo en suspensión de vetiver de 6 meses de edad que hasido sub-cultivado en intervalos semanales. Cuatro días después el sub-cultivo, las células del cultivo en suspensión fueron usadas para la aislación de protoplastos. En este experimento, la soluciónenzimática fue filtro-esterilizada y el lavado de la solución fue esterilizado por autoclave a 1,07kg/cm2, 121°C por 15 minutos. Un mililitro de volumen de células empaquetadas (PCV) de células ensuspensión fue incubado en 4 mL de solución enzimática filtro-esterilizada que consiste en varias enzimas: Celulasa Onokuka R10 (1.0, 2.0 y 3.0%), maceroenzima R10 (1.0, 2.0 y 3.0%) and pectinasa (0.5,...