Protocolo protoplasto

Introducción

Los protoplastos son células de plantas, bacterias u hongos que han perdido totalmente su pared celular, lo cual se logra a través del uso de enzimas que la degraden. El uso de protoplastos permite estudiar la transformación genética en bacteria o células vegetales, ya que es más fácil introducir ADN en ausencia de pared celular. A partir de protoplastos también es posiblellevar a cabo el método de micropropagación y realizar la técnica de fusión de protoplastos, útil en mejoramiento genético vegetal debido a la obtención de tejidos hibridos.

Problemática

La problemática principal en el uso de esta técnica es la falta del establecimiento de un protocolo para la obtención de protoplastos y la compleja metodología que le sigue. La falta de investigación ypublicaciones con respecto a aislamiento de protoplastos en plantas frutales de interés agronómico ha dificultado la utilización y perfeccionamiento de esta técnica.

La regeneración de plantas a partir de protoplastos es difícil, a causa de factores como la manipulación y desinfección de explantes. Desde el punto de vista genético, la problemática está dirigida a que no se puede predecirla ploidía de los híbridos y no se puede recobrar la ploidía normal. En la etapa de propagación de los híbridos, existen problemas a causa de que éstos generalmente son estériles.

Objetivos

✓ Establecer un método de aislamiento de protoplastos

✓ Definir un protocolo de cultivo de protoplastos

✓ Determinar las enzimas apropiadas para la digestión de la pared celularMateriales

Materiales de vidrio, quirúrgico y otros:
• Pipetas Pasteur
• Placas Petri de 60 x 15
• Tubos de ensayo
• Matraz de Erlenmeyer
• Bisturí
• Pinzas
• Parafilm
• Papel filtro
• Micropipetas
• Puntas para micropipetas
• Mecheros
• Material vegetal
• Toalla de papel

Equipos:
• Cámara de flujo laminar
• Pesaanalítica
• Cámara de incubación
• Autoclave
• Centrífuga
• pHmetro
• Espectrofotómetro
• Agitador magnético
• Horno Pasteur

Reactivos:
• Medio de cultivo Kao & Michayluk
• Medio de cultivo Murashige & Skoog
• Sucrosa
• Enzimas
• Alcohol 70%
• Hipoclorito de sodio %
• Agua destilada estéril

Fuentes para la obtención de protoplastosSe pueden obtener protoplastos a partir de cualquier órgano o tejido de una planta, principalmente se usa el mesófilo foliar, tejidos cultivados in vitro como células en suspensión, callos, y ápices de plantas generadas in vitro. Preferentemente, es recomendable usar hojas abiertas de plantas jóvenes o brotes nuevos (4 a 6 semanas de edad.), de cultivos in vitro, ya que, en célulasjóvenes es posible manejar fácilmente la inducción y el mantenimiento de la actividad mitótica que en las células altamente especializadas.
El uso de tejido foliar requiere condiciones controladas para liberar protoplastos de buena calidad, tales como la optimización de luz, temperatura, fertilidad del suelo y humedad. La luz utilizada debe ser de 10000 a 30000 lux y el fotoperiodo de 18 a 16h.1) Aislamiento de Protoplastos

Actualmente, el aislamiento de protoplastos se realiza gracias a un método enzimático, el cual consiste en incubar células en una mezcla de enzimas que degraden la pared celular. Los principales factores a considerar son: los tipos de enzimas que se usarán, la composición del medio en que ellas actuarán y el material de origen de los protoplastos.Enzimas para el aislamiento de protoplastos

Para aislar protoplastos es necesario usar mezclas de enzimas, en lugar de usarlas individualmente. Principalmente, se utilizan: celulasas, hemicelulasas y pectinasas, las cuales se obtienen de preparaciones comerciales. Éstas además contienen otras enzimas tales como proteasas, nucleasas y lipasas. El medio de incubación para aislar...