Informe De Protoplasto



AISLAMIENTO Y CULTIVO DE PROTOPLASTOS



MATERIALES Y METODOS
1. Utilice hojas saludables y maduras que han sido lavadas previamente en agua de la llave.

2. Esterilice en una solución de hipoclorito de sodio al 10%, luego lave tres veces con agua destilada estéril.


3. Proceda a eliminar de la epidermis del envez de las hojas o cotes sobre el tejido para facilitar la acción enzimática.

4.Plasmolice por una hora en manitol al 13% en una caja de Petri.


5. Las hojas cortadas en pequeñas secciones, transfiera a una caja de Petri con 15 ml de solución enzimática que ha sido previamente esterilizada con una membrana de esterilización de nylon (0,45 micrometos), la concentración de las enzimas será: macerozima R10 (al 0,5% P/V) + Celulosa onozuka R10 (2% P/V) disueltas en manitol al 13%a pH 5.4 selle las cajas de petri con parafilm o cristaflex y envuélvalas en papel aluminio.

6. Incube el material durante toda la noche o durante un periodo de 12 a 18 horas a 25°C. Cuando utilice agitacion estos periodos de tiempo pueden ser reducidos a la mitad.


7. Proceda ahora a purificar los protoplastos por medio de filtración y centrifugación, utilice una maya de nylon de 45micrómetros de poro para separar los protoplastos de los restos celulares.

8. Transfiera el filtrado a un tubo de centrifuga y centrifugue a 75 gravedades por 5 minutos, los restos celulares en el sobrenadante retírelos cuidadosamente con una pipeta pasteur (los protoplastos están concentrados en el fondo del tubo).


9. Resuspenda los protoplastos en 10 cm3 del medio de cultivo que consiste en las salesMS más manitol al 13% repita el proceso.

10. Tenga cuidado al resuspender los protoplastos presionando muy suavemente la pera plástica unida a la pipeta pasteur para evitar producir daños a estos.


11. Proceda a tomar una alícuota de los protoplastos y colóquela en un hematocitometro de Fush - Rosentahl (0,2 mm de profundidad de campo).

12. Para determinar su densidad y también su viabilidad. Ladensidad final de cultivo de los protoplastos debe ser de aproximadamente 5 * 104 por ml para evaluar la viabilidad de los protoplastos puede utilizar el diacetato de fluoresceína el cual se acumula en el interior de los plasmalemas de los protoplastos viables y puede ser detectado en un microscopio con florescencia, otro método de valorar viabilidad es colorear los protoplastos con un coloranteal cual los protoplastos viables son impermeables como el colorante azul de Evans, también podemos reportar protoplastos viables aquellos que presentan el fenómeno de ciclosis o corrientes protoplasmáticas.


13. Cultivo de los protoplastos, estos protoplastos se van a cultivar sobre una capa de agar blando 0,75 P/V, adicione 10 ml a la concentración recomendada e incubar a 25 °C y baja intensidadde luz.

14. Regeneración de los protoplastos, los protoplastos que se reproduzcan y formen callos serán subcultivados a medios frescos los cuales se les ha retirado el manitol (reemplazada por la sacarosa) y sin auxinas, condiciones que permitirán el inicio de embriogénesis.












RESULTADOS
Al observar bajo el microscopio no logramos ver la presencia de protoplastos. De igual manera nose obtuvo la regeneración de dichas células, es decir que no hubo obtención de callos. En todos los tratamientos se observó la proliferación de hongos como se muestra a continuación.






Proliferación de hongos en todos los tratamientos





ANALISIS

Teniendo en cuenta que al final de la práctica no se obtuvo la formación de callos, esto nos permite plantear que posiblemente se cometieronerrores al momento de realizar los procedimientos, es decir que quizás no se hizo una desinfección adecuada del material vegetal utilizado; al momento de resuspender los protoplastos se pudieron haber afectados al presionarlos fuertemente ocasionando así daño mecánico. De igual manera las concentraciones de las enzimas celulasa y macerozima y su proceso de incubación quizás no fueron las adecuadas....