aislamiento de DNA de bacterias halógenas
Páginas: 5 (1059 palabras)
Publicado: 10 de abril de 2013
PRACTICA 2. Aislamiento de DNA de Archaes Halof'ilicas Electroforesis de Agarosa
Esta práctica realizada el dia 13/02/2013 tiene como objetivo aislar el DNA de las Haloarchaes (sobreviven en concentraciones altas de sal).
El grupo más antiguo, las arqueo bacterias, constituyen un fascinante conjunto de organismos y por sus especiales características se considera que conforman un Dominioseparado: Archaea.
Fenotípicamente, Archaea son muy parecidos a las Bacterias. La mayoría son pequeños (0.5-5 micras) y con formas de bastones, cocos y espirilos. Las Archaeas generalmente se reproducen por fisión, como la mayoría de las Bacterias. Los genomas de Archaea son de un tamaño sobre 2-4 Mbp, similar a la mayoría de las Bacterias. Si bien lucen como bacterias poseen característicasbioquímicas y genéticas que las alejan de ellas. Por ejemplo:
no poseen paredes celulares con peptidoglicanos
presentan secuencias únicas en la unidad pequeña del ARNr
poseen lípidos de membrana diferentes tanto de las bacterias como de los eucariotas (incluyendo enlaces éter en lugar de enlaces éster).
Poseen una sola molécula de DNA circular
Hoy se encuentran restringidas a hábitatsmarginales como fuentes termales, depósitos profundos de petróleo caliente, fumarolas marinas, lagos salinosos (incluso en el mar Muerto...). Por habitar ambientes "extremos", se las conocen también con el nombre de extremófilas.
Las células de las archeas halofílicas pueden ser lisadas fácilmente si se tratan con agua y este lisado se extrae con fenol. Las proteínas extraídas se separan de losácidos nucleicos que componen el DNA los cuales quedarán en la fase acuosa.
En primer lugar, cogemos un mL del cultivo que contiene las archeas y lo centrifugamos. Despúes tenemos que recoger el líquido que sobra por encima ya que las células se quedan al final y añadimos 200 micro litros de agua ultra pura ( más limpia que el agua destilada). Al añadir el agua se produce una diferencia de presiónosmótica ya que el H2O entra en la célula y esta estalla, proceso denominado plasmólisis; con un agitador de tubos lo agitamos para que el precipitado se quede disuelto y posteriormente añadimos también 200 micro litros de fenol, el cual quema lo demás menos el DNA y tras remover por inversión calentamos la mezcla a 65º para que se homogenice durante 10 minutos. Centrifugamos y con un cuenta gotaslo pasamos a otro eppendorf al cual añadimos 400 micro litros de etanol absoluto y movemos por inversión.( No se puede agitar ya que se rompe el DNA). El precipitado de DNA es visible a simple vista como se observa en la figura 2.1. El hilo se pesca con un cuenta gotas y se le añade 100 micro litros de agua pura y lo introducimos a la máquina Bórtex.
A la semana siguiente cuandovolvemos al laboratorio de prácticas vamos a realizar la electroforesis. El gel de agarrosa ya está preparado. Para hacerlo se pesan 0,30 gr en un Erlenmeyer y se añaden 400 mL de tampón 1xTAE. Se calienta (en el microondas preferentemente) hasta que la agarosa se disuelva y se añaden 2 micro litros de un gel fluorescente denominado red safe el cual se intercala entre las bases nitrogenadas delDNA), se coloca en el molde y se ponemos el peine para formar unos huecos; se deja solidificar.
Para realizar la electroforesis se llena el tanque con tampón 1xTAE y se coloca el gel y cargamos la muestra de DNA con una micro pipeta recogiéndola después de haber sido teñida con una mezcla de colorante azul. Se introduce en el hueco del gel y esperamos hasta que el DNA migre al otro polo porquecontiene carga - debido al grupo fosfato y busca la carga +.
Si el DNA es grande avanzará menos. Lo encontramos fragmentado lo cual estamos observando gracias a la luz ultravioleta. En nuestros experimentos solamente observamos una banda de uno de DNAs debido a su poca masa.
En conclusión, cualitativamente si el DNA es de alto peso molecular (PM) ha avanzado poco. Observamos también que...
Esta práctica realizada el dia 13/02/2013 tiene como objetivo aislar el DNA de las Haloarchaes (sobreviven en concentraciones altas de sal).
El grupo más antiguo, las arqueo bacterias, constituyen un fascinante conjunto de organismos y por sus especiales características se considera que conforman un Dominioseparado: Archaea.
Fenotípicamente, Archaea son muy parecidos a las Bacterias. La mayoría son pequeños (0.5-5 micras) y con formas de bastones, cocos y espirilos. Las Archaeas generalmente se reproducen por fisión, como la mayoría de las Bacterias. Los genomas de Archaea son de un tamaño sobre 2-4 Mbp, similar a la mayoría de las Bacterias. Si bien lucen como bacterias poseen característicasbioquímicas y genéticas que las alejan de ellas. Por ejemplo:
no poseen paredes celulares con peptidoglicanos
presentan secuencias únicas en la unidad pequeña del ARNr
poseen lípidos de membrana diferentes tanto de las bacterias como de los eucariotas (incluyendo enlaces éter en lugar de enlaces éster).
Poseen una sola molécula de DNA circular
Hoy se encuentran restringidas a hábitatsmarginales como fuentes termales, depósitos profundos de petróleo caliente, fumarolas marinas, lagos salinosos (incluso en el mar Muerto...). Por habitar ambientes "extremos", se las conocen también con el nombre de extremófilas.
Las células de las archeas halofílicas pueden ser lisadas fácilmente si se tratan con agua y este lisado se extrae con fenol. Las proteínas extraídas se separan de losácidos nucleicos que componen el DNA los cuales quedarán en la fase acuosa.
En primer lugar, cogemos un mL del cultivo que contiene las archeas y lo centrifugamos. Despúes tenemos que recoger el líquido que sobra por encima ya que las células se quedan al final y añadimos 200 micro litros de agua ultra pura ( más limpia que el agua destilada). Al añadir el agua se produce una diferencia de presiónosmótica ya que el H2O entra en la célula y esta estalla, proceso denominado plasmólisis; con un agitador de tubos lo agitamos para que el precipitado se quede disuelto y posteriormente añadimos también 200 micro litros de fenol, el cual quema lo demás menos el DNA y tras remover por inversión calentamos la mezcla a 65º para que se homogenice durante 10 minutos. Centrifugamos y con un cuenta gotaslo pasamos a otro eppendorf al cual añadimos 400 micro litros de etanol absoluto y movemos por inversión.( No se puede agitar ya que se rompe el DNA). El precipitado de DNA es visible a simple vista como se observa en la figura 2.1. El hilo se pesca con un cuenta gotas y se le añade 100 micro litros de agua pura y lo introducimos a la máquina Bórtex.
A la semana siguiente cuandovolvemos al laboratorio de prácticas vamos a realizar la electroforesis. El gel de agarrosa ya está preparado. Para hacerlo se pesan 0,30 gr en un Erlenmeyer y se añaden 400 mL de tampón 1xTAE. Se calienta (en el microondas preferentemente) hasta que la agarosa se disuelva y se añaden 2 micro litros de un gel fluorescente denominado red safe el cual se intercala entre las bases nitrogenadas delDNA), se coloca en el molde y se ponemos el peine para formar unos huecos; se deja solidificar.
Para realizar la electroforesis se llena el tanque con tampón 1xTAE y se coloca el gel y cargamos la muestra de DNA con una micro pipeta recogiéndola después de haber sido teñida con una mezcla de colorante azul. Se introduce en el hueco del gel y esperamos hasta que el DNA migre al otro polo porquecontiene carga - debido al grupo fosfato y busca la carga +.
Si el DNA es grande avanzará menos. Lo encontramos fragmentado lo cual estamos observando gracias a la luz ultravioleta. En nuestros experimentos solamente observamos una banda de uno de DNAs debido a su poca masa.
En conclusión, cualitativamente si el DNA es de alto peso molecular (PM) ha avanzado poco. Observamos también que...
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