Aislamiento Y Caracterizacion De Dna

RESULTADOS:
-Caracterización de DNA obtenido, pureza y concentración
Tabla.- 1 Lecturas de absorbencia obtenidas por los diferentes equipos a longitudes de onda de 260nm y 280 nm así como la pureza obtenida y las concentraciones determinadas por dos diferentes formulas.
Equipo | Absorbencia a 260 nm | Absorbencia a 280 nm | Dilución | Concentración22500 | Concentración(50) | Pureza |
7 |0.732 | 0.357 | 1:6 | 195 | 219 | 2.05 |
8 | 0.76 | 0.34 | 1:3 | 101.33 | 114 | 2.25 |
9 | 0.695 | 0..30 | - | 30.88 | 34.75 | 2.26 |
10 | 0.5262 | 0.2535 | 1:3 | 70.16 | 78.93 | 2.07 |
11 | 0.84 | 0.41 | 1:7 | 261.31 | 294 | 2.063 |
12 | 0.722 | 0.3501 | 1:5 | 160.5 | 180.6 | 2.0634 |

* Cálculos equipo 7 (marcados en rojo en la tabla 1)
En base a la ecuación de la ley delambert-bouger-beer.
Tenemos que:

A =a*b*c donde:
a = Absorbencia (en este caso obtenida a 260 nm)
a = índice de Absorción especifica
b = la porción por la cual pasa el haz de luz
c = la concentración de solución

Despejando obtenemos que la concentración está dada por:

C= Abs.260nmAbs.especfica x b = 0.732822500 x 1cm x 106 x 6 = 195 μgml

Nota: se multiplico por 106 paratransformar a microgramos sobre mililitro y después por la dilución realizada que en este caso fue de 1:6

En base a la relación tenemos que:

1 unidad de As 260nm de DNA = 50μgml de DNA de doble cadena
De doble cadena

1 unidad de Abs260nm ------------------- 50μgml de DNA de doble cadena
0.728 --------------------------------------- X

X= 219 μgml de DNA de doble cadena
-Espectrode absorción de DNA
Dilución 1:4 (datos del aislamiento de DNA del equipo 8.)

Tabla.-2 absorbencias obtenidas a diferentes longitudes de onda 200 a 280 nm

Longitud de onda λ (nm) | Absorbancia |
200 | 1.689 |
205 | 1.421 |
210 | 1.163 |
215 | 0.909 |
220 | 0.632 |
225 | 0.431 |
230 | 0.380 |
235 | 0.412 |
240 | 0.511 |
245 | 0.643 |
250 | 0.772 |
255 | 0.851|
260 | 0.859 |
265 | 0.791 |
270 | 0.687 |
275 | 0.549 |
280 | 0.382 |

Figura 1.- Espectro de absorción de DNA aislado en el laboratorio en un rango de 200nm a 280 nm

Figura 2.- Espectro de absorción típico de DNA

Anexo: problema de calculo de Tm (temperatura media de desnaturalización)

Temperatura | Absobancia a 260 nm |
75 | 0,392 |
78 | 0,395 |
82 | 0,435 |84 | 0,485 |
86 | 0,5 |
88 | 0,53 |
90 | 0,55 |
93 | 0,556 |

Figura 3.- Grafica en la cual se representa las diferentes temperaturas con sus respectivas lecturas de absorbancia para la obtención de Tm

Abs260nm90 grados C-Abs260nm (78 grados C)2= 0.555-0.3952= 0.08
0.395+0.08 = 0.475 interpolación en grafica
Tm= 83.6
(G+C)= 83.6 - 69.3/0.41 =34.87 %
(A+T)= 100 – 34.87% = 65.13%INFLUENCIA DE CONTENIDO GC
1.-
Oligo: 5'-GGGCGTATATGGGGTATATAGGCGGCGCGCATATATTATA-3'
Primer1: 40 bases
Composition 10 A; 5 C; 14 G; 11 T; 0 OTHER
Percentage: 25% A; 12% C; 35% G; 27% T; 0%OTHER
MW=12.52 kDa
Hybridization: D:D
Salt: 50 mM
Formamide: 0%
Mismatch: 0 bp
Thermo Tm = 77.0 °C %GC Tm = 66.9 °C GC+AT Tm = 118.0°C
2.-
Oligo:5'-ATATATATATATATATATATATATATATATCGCGCGCGCG-3'
Primer1: 40 bases
Composition 15 A; 5 C; 5 G; 15 T; 0 OTHER
Percentage: 37% A; 12% C; 12% G; 37% T; 0%OTHER
MW=12.34 kDa
Hybridization: D:D
Salt: 50 mM
Formamide: 0%
Mismatch: 0 bp
Thermo Tm = 63.0 °C %GC Tm = 57.7 °C GC+AT Tm = 100.0°C

3.-
Oligo: 5'-CGCGGATATTTATATATATATATATATATTTTAATTATAT-3'
Primer1: 40 bases
Composition 15 A; 2 C; 3 G;20 T; 0 OTHER
Percentage: 37% A; 5% C; 7% G; 50% T; 0%OTHER
MW=12.34 kDa
Hybridization: D:D
Salt: 50 mM
Formamide: 0%
Mismatch: 0 bp
Thermo Tm = 57.0 °C %GC Tm = 52.5 °C GC+AT Tm = 90.0 °C

INFLUENCIA DE LA VARIACION EN LA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS
1.-
Oligo: 5'-GCGCGCGTATATATATATATATTATATATATAGCGCGCGC-3'
Primer1: 40 bases
Composition 12 A; 7 C; 8 G; 13 T; 0 OTHER...