Aislamiento y purificación DNA de un plasmido

39. Aislamiento y purificación del DNA de un
plásmido recombinante
Aurora Galván Cejudo, Manuel Tejada, Antonio Camargo, José
Javier Higuera, Vicente Mariscal, Emilio Fernández Reyes
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

El DNA de un plásmido recombinante presente en una bacteria se aísla
por unmétodo rápido y sencillo (“miniprep”) que consiste en lisis
bacteriana, precipitación de proteínas y DNA genómico, y finalmente
precipitación del DNA plasmídico. El objetivo es obtener suficiente
cantidad del DNA para su análisis posterior mediante electroforesis.
Palabras clave: DNA plasmídico, lisis alcalina, eficiencia de la purificación
Abreviaturas empleadas. DNA: ácidodesoxirribonucleico; IPTG, isopropil-β-Dtiogalactopiranósido; LB: medio de Luria-Bertani; RNasa, Ribonucleasa.

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, circular y
generalmente de pequeño tamaño que se encuentran en muchas especies
bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA
cromosómico. A diferencia de éste, los plásmidos no son necesariospara la
viabilidad general de la célula, pero pueden contener genes que contribuyen a
la supervivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia
a antibióticos, a metales etc. Algunas clases de plásmidos poseen además la
propiedad conocida como "replicación relajada", esto es, están presentes en
forma de muchas copias por célula, lo que facilita enormemente su aislamiento
ypurificación.
Los plásmidos poseen un interés singular en Ingeniería Genética por ser uno
de los sistemas vectores más sencillos de usar. Un vector de clonación es un
sistema que permite introducir en una célula hospedadora un fragmento de
DNA que se pretende clonar; en esta célula hospedadora el vector se replica y
expresa, en su caso. La molécula que resulta de la unión de un DNA vectorcon
el DNA de interés (denominado entonces "inserto") se denomina molécula de
vector recombinante.
Para ser utilizado como vector de clonación, un plásmido ideal debe poseer
al menos tres características: 1) Debe tener su propio origen de replicación y
por tanto la capacidad de replicación autónoma independiente del genoma del
hospedador. 2) Debe tener sitios de clonación múltiple que permitanla apertura
del DNA con enzimas de restricción y hace posible la clonación de insertos de
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DNA en la forma y orientación determinada. 3) Debe poseer marcadores
genéticos seleccionables que permitan aislar las células hospedadores que
contengan el vector. La mayoría de los plásmidos naturales no cumplen todas
estas condiciones, por lo que una primera tarea de la Ingeniería Genética haconsistido en la construcción de plásmidos artificiales, combinando en una
misma molécula diversos rasgos útiles procedentes de los plásmidos naturales.
La presencia en el plásmido del gen de resistencia a ampicilina permite
seleccionar las bacterias que portan estos plásmidos, gracias a su capacidad
para crecer en presencia de dicho antibiótico (el gen de resistencia codifica una
betalactamasa, enzima que degrada la ampicilina).
La mayoría de los plásmidos usados en Biologia Molecular contienen el sitio
de clonación múltiple dentro el gen de la β-galactosidasa lo que permite la
interrupción e inactivación de este gen cuando un DNA inserto se clona en esta
región. En medios de cultivo que contengan el análogo de la lactosa X-gal, esta
estrategia permite distinguir las coloniasbacterias que contienen el vector
recombinante (con inserto) de aquellas que han recibido un vector no
recombinante (sin inserto). Las bacterias que reciben el vector recombinante no
pueden utilizar lactosa ni su análogo y formará colonias blancas. Las bacterias
que reciben un vector no recombinante sí pueden utilizar la lactosa o su
análogo y formarán colonias azules.
El objetivo de esta...