Aislamiento y determinación de ácidos nucleicos

Aislamiento y determinación de ácidos nucleicos
El objetivo de esta práctica es extraer y cuantificar los ácidos nucleicos que se encuentran presentes en el tejido de un hígado de ternera.
Introducción
La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayoría de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. En este caso,los métodos de extracción permiten obtener ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos.
Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos de células. El procedimiento de lisis idóneo suele consistir en un equilibrio detécnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial (un tejido), pero suficientemente suave para preservar el ácido nucleico. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:
• Rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.);
• Tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles, etc.);
• Digestión enzimática (Proteinasa K,etc.).
Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo. Por ejemplo, una misma solución puede contener detergentes que solubilicen las membranas celulares y sales caotrópicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares. Tras la lisis celular y la inactivación de las nucleasas, los restos de células se eliminan fácilmente por filtración oprecipitación.
A menudo se efectúa una extracción con disolventes para eliminar los contaminantes de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una combinación de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las proteínas. Para concentrar los ácidos nucleicos suele realizarse una precipitación con isopropanol o etanol.
El ADN, el ARN, los oligonucleótidos e incluso los mononucleótidos puedencuantificarse directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir, midiendo la absorbancia A (o densidad óptica, DO) de luz ultravioleta (también puede hacerse en el intervalo visible). Si la muestra es pura, es decir, no contiene cantidades significativas de contaminantes como proteínas, fenol o agarosa, la medición espectrofotométrica de la irradiación ultravioleta absorbida por lasbases es sencilla y exacta. En este método, los tampones acuosos con escasa concentración iónica (por ejemplo, tampón TE) resultan idóneos. La concentración de ácidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y comparando con un blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un «cociente». Dado que las proteínas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 paracalcular la pureza de los ácidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una absorción a 230 nm significa que la muestra está contaminada con hidratos de carbono, péptidos, fenoles, compuestos aromáticos u otras sustancias. El cociente A260/A230 de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente.

Instrumental
Tejido animal.
Tubos de ensayo ytubos Falcon®.
Varilla de vidrio y pipeta Pasteur de vidrio.
Cubetas de cuarzo.
Centrifugadora de mesa.
Espectrofotómetro.

Reactivos
Detergente/tampón salino.
Fenol/cloroformo/alcohol isoamílico.
Acetato sódico 3M pH 5,2.
Tampón tris-EDTA.
Etanol absoluto.

Procedimiento
Ponemos 0.23 g de hígado en un tubo Falcon® de 15 ml (tubo de fondo redondo con tapón de rosca) y lo disgregamoslo máximo posible con una varilla de vidrio contra las paredes del tubo. Procuramos que no caiga al fondo del tubo, pues la varilla no llega bien y quedaría sin disgregar.
Una vez que el trozo de hígado está bien deshecho le añadimos 10 veces el peso del hígado de detergente/tampón salino (2,3 ml), y a esa disolución le agregamos el mismo volumen de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y agitamos...