Determinación De Ácidos Nucleicos

12/‎04/‎2012
TP n° 2 Segunda parte: COMPUESTOS ORGÁNICOS. Los elementos químicos de la vida
Determinación de ácidos nucleicos -extracción de DNA. Procedimiento-
Objetivos generales
I. Adquirir destreza en el manejo y cuidado del material de laboratorio.
II. Determinaren forma cualitativa la presencia de compuestos de carbono en materiales biológicos, identificar qué clase/tipo de molécula son, a través de reacciones químicas.
III. Determinar algunas propiedades de las macromoléculas.
IV. Relacionar sus estructuras con las funciones que estos desempeñan.
Objetivo específico
Extracción de DNA a partir de media banana.
Materiales
* mortero y pilón(en reemplazo de la licuadora)
* vasos de precipitados
* varilla de vidrio
* tubos de ensayo (8)
* gradilla
* colador
* pipeta (podría haberse empleado una propipeta)
* agua destilada fría (200 mL)
* sal de mesa (NaCl) (1.5 g)
* detergente líquido (30 mL)
* cloroformo (8 mL)
* alcohol etílico
* 1/2 banana

Métodos
1. Se abrió una banana y setrozó la mitad de ella. Luego, se la trituró con un mortero y un pilón hasta formar una pasta o puré.
2. Se colocó el puré de banana en un vaso de precipitados de 500 mL. y se le adicionaron 200 mL de agua destilada fría y 1.5 g de cloruro de sodio.
3. Se agitó la preparación con una varilla de vidrio.
4. Se coló la mezcla para separar el sobrenadante (fracción más líquida) defragmentos más grandes de pulpa de banana no disgregada y se volvió a agitar con varilla de vidrio.
5. Se transpasó a un vaso de precipitados (en lugar de a una probeta -como indicaba el protocolo seguido-) de mayor tamaño (600 mL).
6. Se midió el volumen del licuado obtenido (210 mL), se calculó la sexta parte de dicho volumen y se agregó en forma de detergente líquido (35 mL de detergente).7. Se mezcló suavemente el licuado con el detergente líquido y se dejó reposar la mezcla durante, aproximadamente, 10 min.
8. Se vació el preparado en 8 tubos de ensayo sostenidos y almacenados en una gradilla, llenándolos hasta su tercera parte.
9. Se agregararon 2 mL de cloroformo a cada tubo (finalmente, se emplearon únicamente 4 de los 8 tubos de ensayo) y se los agitó muy suave ydelicadamente. Se observó la formación de dos fases.
10. Se tomó un tubo de ensayo, se lo inclinó levemente y se adicionó poco a poco alcohol etílico obtenido con una pipeta, haciéndolo deslizarse por las paredes del tubo, hasta tener la misma cantidad que de jugo de banana. Se repitió este paso en los otros 3 tubos. Se observó la formación de una tercera fase.
11. Se vio cómo el DNAascendía hasta la parte superior del tubo de ensayo.
12. Se introdujo una varilla de vidrio (más pequeña que la utilizada para agitar) hasta justo debajo de las fases superior e intermedia y se removió la varilla hacia adelante y hacia atrás para ir, poco a poco, enrollando los fragmentos de mayor tamaño de DNA. Se retiró la varilla con sumo cuidado, atravesando la capa de alcohol, y se colocaronlos fragmentos obtenidos de los 4 tubos de ensayo en un 5to tubo.
Resultados
Todos los pasos realizados poseen un fundamento que ayuda a comprender la experiencia. En primer lugar, las acciones mecánicas llevadas a cabo con el mortero y la varilla de vidrio, son primordiales para poder llegar a romper la pared celular y la membrana plasmática y acceder al núcleo de la célula, donde estácontenido el DNA que debe ser liberado.
Por otra parte, el NaCl, el detergente, el cloroformo y el alcohol son elementos esenciales para poder lograr el objetivo de la experiencia. Su uso se justifica de la siguiente manera:
- La sal de mesa (NaCl) colabora en la lisis celular y, por otro lado, crea una capa iónica que recubre el DNA y lo protege evitando la unión de las proteínas a él.
- El...