Ajonjolì

Determinación de proteínas, carbohidratos y lípidos en semillas
de ajonjolí germinadas y sin germinar
Objetivo: encontrar la variación de los compuestos de reserva de la semilla de ajonjolí en su
germinación para llegar a plántula y su relación metabólica.
Palabras clave: germinación, lípidos, carbohidratos, proteínas, ajonjolí, ciclo del glioxilato.
Germinación de las semillas deajonjolí
El ajonjolí es una semilla con un alto contenido de aceite que va del 55 al 50% de su peso total. La semilla de
ajonjolí requiere temperaturas altas y uniformes de entre 27 y 30°C para germinar.
• Es muy importante lavarse muy bien las manos antes de iniciar las manipulaciones para evitar
que las semillas se contaminen.
• Pese tres lotes de semillas de ajonjolí, cada uno de 0.5 g.
• Cadalote de semillas se coloca en un frasco “Gerber” NO estéril. Las semillas se desinfectan con 25
mL de una solución de hipoclorito de sodio al 1% por 5 min., para facilitar el lavado el frasco se tapa con
una capa de gasa sujetada por una liga y las semillas se enjuagan perfectamente con agua estéril,
hasta que el olor del cloro desaparezca.
• Etiquete sus frascos “Gerber” estériles yhumedezca el papel filtro del frasco con agua estéril,
introduzca las semillas a cada frasco (con la ayuda de una espátula) cuidando que no queden por
debajo del papel filtro, agrégueles agua estéril resbalándola por la pared del frasco, suficiente para
iniciar el proceso, pero sin dejar a las semillas totalmente cubiertas de agua para evitar que se
ahoguen.
• Ponga a incubar susfrascos a 28 °C, y revise sus semillas al siguiente día para verificar que tengan el
agua suficiente; si es necesario agrégueles más agua. ¡OJO NO confundan las raicillas con
contaminación!
• Las semillas se dejan incubar cuatro días. El día de la práctica pese tres lotes de semillas de ajonjolí,
cada uno de 0.5 g.
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
1. Los lotes de semillas sin germinary germinadas se muelen en morteros fríos, y se les agrega a cada uno 10 mL de
amortiguador de fosfatos pH 7.5, MgCl 3 mM para homogeneizarlos.
2. Los homogeneizados se centrifugan a 15 000 rpm durante 15 min.
3. Si es necesario, los sobrenadantes se filtran para que queden claros y se mantienen en frío mientras se utilizan.
4. Se toman 150 μL y se colocan en un tubo de microfuga, seagregan 75 μL de TCA 10%, esto se hace por
duplicado para cada lote. Se agita en un vórtex.
5. Los tubos se centrifugan a 10 000 rpm, por 5 min en una microfuga.
6. El sobrenadante se descarta y el precipitado se resuspende en 3 mL de una solución 1:1 de SDS 10% y NaOH
0.8 N.
7. Se lee a 280 nm contra un blanco de la solución SDS/NaOH .
8. Para realizar los cálculos de concentración deproteínas tome en cuenta los valores del Ε y el PM de la albúmina.
DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS
1. Los lotes de semillas sin germinar y germinadas se muelen en morteros fríos, y se les agrega a cada uno 5 mL de
etanol al 75% frío, se filtran los homogeneizados en tubos de centrifuga, se agregan 5 mL mas de etanol a cada
mortero para lavarlos y añadirlo a los tubos.
2. Los homogeneizados secentrifugan a 15 000 rpm durante 15 min.
3. Si es necesario, los sobrenadantes se filtran para que queden claros y se mantienen en frío mientras se utilizan.
4. Preparar tubos con los reactivos que se indican en la tabla 1:
Tabla 1.
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Sol. patrón de glucosa (mL) 0.02
5
0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
H2O destilada 0.97
5
0.95 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.9 0.9 0.9 0.9 1.0Extracto enzimático sin germinar diluido 1:20 0.1
Extracto enzimático sin germinar diluido 1:50 0.1
Extracto enzimático germinado diluido 1:20 0.1
Extracto enzimático sin germinar diluido 1:50 0.1
Los tubos se agitan en el vórtex
¡¡¡Los siguientes pasos se realizan en la campana de extracción!!!
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Fenol 5% (mL) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3...