Alimentos

B.10 .Método para la Cuenta de Microorganismos Coliformes Totales en Placa.
B.10.1 Fundamento del método
El método permite determinar el número de microorganismos coliformes presentes en una muestra, utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35°C en aproximadamente 24 h, dando como resultado la producción de gas y ácidos orgánicos, los cualesviran el indicador de pH y precipitan las sales biliares

MATERIAL |
3 PIPETAS SEROLOGICAS DE 10 ML | Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca |
3 PIPETAS SEROLOGICAS DE 1 ML | 1 cuchillo esteril |
Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca | 1 cuchara |
Microscopio óptico. | 1 espatula |
Baño de agua con control de temperatura | Cajas Petri. |
2 Asas bacteriologica |Mechero fischer |
MATERIAL SOLN FOSFATOS |
Matraz aforacion 1 lt | pizeta |
Perilla | Pipeta serológica 1 ml |

REACTIVOS |
*Soluciones Diluyentes Solución Reguladora de Fosfatos Fosfato monopotásico: 34,0 gAgua : 1 ltNaOH1.0 N : 4 g en 100 ml | Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0N. Llevar con agua a un litro. Esterilizar a 121± 1,0°C durante 15 minutos. Conservar en refrigeración (solución concentrada).Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo). Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según serequiera. Esterilizar durante 15 minutos a 121± 1,0°C. Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales |
Agua PeptonadaPeptona : 1,0 gNaCl : 8,5 gAgua : 1 ltNaOH 1.0 N: 4 g en 100 ml | Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustarel pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0 N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera. Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0°C. Después de la esterilización, los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales.Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición. |
Medio de Cultivo Agar-rojo-violeta-bilis-lactosa (RVBA | Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos. Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídrico 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N a 25°C, de forma que después del calentamiento se mantengaen este valor. Calentar con agitación constante y hervir durante 2 minutos. Enfriar inmediatamente el medio en un baño de agua hasta que llegue a 45°C. Evitar el sobrecalentamiento del medio. No debe esterilizarse en autoclave. Usar el medio dentro de las tres primeras horas después de su preparación |

B.10.6 Procedimiento
1. Colocar en cajas Petri por duplicado 1 mL de la muestra líquidadirecta o de la dilución primaria
2. Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución.
3. Vertir de 15 a 20 mL del medio RVBA fundido y mantenido a 45 ± 1,0°C en baño de agua. En el caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vierte de 10 a 15 mL del medio. El tiempo transcurrido entre la preparación dela dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.

4. Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa y...