ANALISIS ELECTROFORETICO DNA
Páginas: 8 (1883 palabras)
Publicado: 30 de marzo de 2014
PRACTICA N° 3
ANALISIS ELECTROFORETICO DEL DNA
I. INTRODUCCION:
La electroforesis es una técnica de laboratorio utilizada para separar moléculas cargadas colocadas en un campo eléctrico. Las moléculas cargadas positivamente se desplazarán hacia el polo negativo y las cargadas negativamente hacia el polo positivo. Uno de los factores que afecta la separación de las moléculas en unaelectroforesis es su carga. Para el caso del DNA, los grupos fosfato le dan la carga a la molécula. Los grupos fosfato son grupos ácidos con pK bajos, esto significa que a pH neutro (7.0 – 7.5) sus grupos hidroxilo pierden los protones (H+) y quedan cargados negativamente. Por lo anterior, los ácidos nucleicos (DNA y RNA) son moléculas cargadas negativamente a pH neutro, en un sistema electroforético sedesplazarán hacia el polo positivo.
Un mecanismo para separar moléculas por electroforesis se basa en que tengan diferente carga, ello hace que se desplacen hacia uno u otro polo y que lo hagan a diferente velocidad, es decir, separación de moléculas por diferencia en su movilidad electroforética. Para el caso del DNA, se considera que, independiente de su tamaño, todos tienen la mismamovilidad electroforética. Para separar moléculas de DNA de diferente tamaño se incluye en el sistema la utilización de geles, tanto de agarosa como poliacrilamida (acrilamida más bis-acrilamida).
El gel consiste en un soporte sólido, poroso, a través del cual el DNA tiene que desplazarse durante la electroforesis. Las moléculas de menor tamaño se desplazarán a una mayor velocidad que las moléculasde mayor tamaño. Todas las de un determinado tamaño se desplazarán la misma distancia en un tiempo dado.
Cuando se utilizan geles de poliacrilamida la resolución de las electroforesis de DNA es mayor, es decir, permite discriminar entre DNAs con diferencias mínimas de tamaño, en el caso de las electroforesis de secuenciación, permite diferenciar un DNA de 100 bases de otro de 101 bases.
Por sunaturaleza y por las cantidades pequeñas que manejamos en el laboratorio, el DNA no es visible al ojo humano. Para visualizar el DNA utilizamos técnicas de coloración. La más usada por su sensibilidad, sencillez y rapidez es la visualización con bromuro de etidio. El bromuro de etidio es una sustancia que se intercala entre las bases nitrogenadas del DNA y al excitarlo con luz ultravioleta emiteluz visible, es decir, es una sustancia fluorescente. El bromuro de etidio es mutagénico y para su visualización se requiere de una lámpara de luz ultravioleta, por esas razones su aplicación con fines académicos ha sido limitada. Recientemente contamos con un colorante seguro para visualizar DNA, Bio-Safe DNA, aunque de menor sensibilidad, evita los inconvenientes del bromuro de etidio, no esmutagénico y para la visualización no se requiere lámpara de luz ultravioleta. La sensibilidad del bromuro de etidio es de 1 ng, mientras para Bio-safe de 10 ng.
Una vez separados los ácidos nucleicos, estos pueden ser transferidos a membranas (papel) de celulosa o nylon por capilaridad.
La electroforesis se hace con varias finalidades: evaluar el resultado de un proceso de extracción de DNA,comparando un DNA de concentración y tamaño conocidos se puede estimar el tamaño y cantidad de otro, evaluar el resultado de una amplificación realizada por PCR, separar DNA de diferente tamaño (producidos al cortar con enzimas de restricción), separar DNA para transferirlo a membranas con el fin de hacer hibridación con sondas, etc.
La extracción de DNA, corte con enzimas de restricción,separación por electroforesis, transferencia a membranas y la hibridización con sondas; son procedimientos que se realizan con fines diagnósticos, identificación de personas en medicina forense y en estudios de paternidad, entre otros
II. OBJETIVOS:
Realizar la corrida electroforética del DNA genómico
Determinar el peso molecular de las muestras de DNA por comparación con un marcador...
PRACTICA N° 3
ANALISIS ELECTROFORETICO DEL DNA
I. INTRODUCCION:
La electroforesis es una técnica de laboratorio utilizada para separar moléculas cargadas colocadas en un campo eléctrico. Las moléculas cargadas positivamente se desplazarán hacia el polo negativo y las cargadas negativamente hacia el polo positivo. Uno de los factores que afecta la separación de las moléculas en unaelectroforesis es su carga. Para el caso del DNA, los grupos fosfato le dan la carga a la molécula. Los grupos fosfato son grupos ácidos con pK bajos, esto significa que a pH neutro (7.0 – 7.5) sus grupos hidroxilo pierden los protones (H+) y quedan cargados negativamente. Por lo anterior, los ácidos nucleicos (DNA y RNA) son moléculas cargadas negativamente a pH neutro, en un sistema electroforético sedesplazarán hacia el polo positivo.
Un mecanismo para separar moléculas por electroforesis se basa en que tengan diferente carga, ello hace que se desplacen hacia uno u otro polo y que lo hagan a diferente velocidad, es decir, separación de moléculas por diferencia en su movilidad electroforética. Para el caso del DNA, se considera que, independiente de su tamaño, todos tienen la mismamovilidad electroforética. Para separar moléculas de DNA de diferente tamaño se incluye en el sistema la utilización de geles, tanto de agarosa como poliacrilamida (acrilamida más bis-acrilamida).
El gel consiste en un soporte sólido, poroso, a través del cual el DNA tiene que desplazarse durante la electroforesis. Las moléculas de menor tamaño se desplazarán a una mayor velocidad que las moléculasde mayor tamaño. Todas las de un determinado tamaño se desplazarán la misma distancia en un tiempo dado.
Cuando se utilizan geles de poliacrilamida la resolución de las electroforesis de DNA es mayor, es decir, permite discriminar entre DNAs con diferencias mínimas de tamaño, en el caso de las electroforesis de secuenciación, permite diferenciar un DNA de 100 bases de otro de 101 bases.
Por sunaturaleza y por las cantidades pequeñas que manejamos en el laboratorio, el DNA no es visible al ojo humano. Para visualizar el DNA utilizamos técnicas de coloración. La más usada por su sensibilidad, sencillez y rapidez es la visualización con bromuro de etidio. El bromuro de etidio es una sustancia que se intercala entre las bases nitrogenadas del DNA y al excitarlo con luz ultravioleta emiteluz visible, es decir, es una sustancia fluorescente. El bromuro de etidio es mutagénico y para su visualización se requiere de una lámpara de luz ultravioleta, por esas razones su aplicación con fines académicos ha sido limitada. Recientemente contamos con un colorante seguro para visualizar DNA, Bio-Safe DNA, aunque de menor sensibilidad, evita los inconvenientes del bromuro de etidio, no esmutagénico y para la visualización no se requiere lámpara de luz ultravioleta. La sensibilidad del bromuro de etidio es de 1 ng, mientras para Bio-safe de 10 ng.
Una vez separados los ácidos nucleicos, estos pueden ser transferidos a membranas (papel) de celulosa o nylon por capilaridad.
La electroforesis se hace con varias finalidades: evaluar el resultado de un proceso de extracción de DNA,comparando un DNA de concentración y tamaño conocidos se puede estimar el tamaño y cantidad de otro, evaluar el resultado de una amplificación realizada por PCR, separar DNA de diferente tamaño (producidos al cortar con enzimas de restricción), separar DNA para transferirlo a membranas con el fin de hacer hibridación con sondas, etc.
La extracción de DNA, corte con enzimas de restricción,separación por electroforesis, transferencia a membranas y la hibridización con sondas; son procedimientos que se realizan con fines diagnósticos, identificación de personas en medicina forense y en estudios de paternidad, entre otros
II. OBJETIVOS:
Realizar la corrida electroforética del DNA genómico
Determinar el peso molecular de las muestras de DNA por comparación con un marcador...
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