articulo cientifico

UNIVERSIDAD DE NARIÑO
PRACTICA DE BIOQUÍMICA PARA MEDICINA- CINÉTICA ENZIMÁTICA

Objetivos:

1. Reconocer la importancia del estudio cinético de la enzima catalasa.
2. Discutir el efecto delos diferentes agentes físicos y químicos sobre la actividad enzimática.
3. Analizar el comportamiento de las enzimas en presencia de diferentes concentraciones de sustrato.
4. Determinargráficamente el comportamiento cinético de la catalasa.

Introducción:

Fundamento de la práctica

Una forma de medir la actividad de la catalasa, es colocarla en presencia del sustrato un tiempodeterminado, luego detener la reacción por desnaturalización y finalmente cuantificar el sustrato residual. En la práctica a realizarse la acción de la enzima se detiene al agregar H2SO4 6N. Lacuantificación del sustrato no transformado (residual) se medirá mediante titulación con permanganato de potasio de acuerdo a la siguiente reacción:

2 MnO4-- + 5 H2O2 + 6 H+ --------- 5O2 + 2 Mn+2 +8 H2O

Materiales y reactivos

- Centrígufa - Tubos de ensayo
- Tubos heparinizados - Erlenmeyers
- Jeringas - Pipetas graduadas
- Algodón - KMnO4 0.002 M
- Baño 95º C - H2SO46N
- Pipetas plásticas - KCN 0.5 M
- Cronómetro - Buffer fosfato
- Soporte universal 50 mM pH 7.0
- Pinza para bureta 50 mM pH 6.0
- Baño hielo 50 mM pH 8.0
- Buretas -Peróxidos de Hidrógeno 0.09 M
- Solución de catalasa 0.2%
La práctica debe realizarse a 4 º C, debido al elevado número de recambio de esta enzima durante un período de 7 minutos.

Procedimiento

1.Extracto Enzimático: En un tubo heparinizado colocar 5 ml de sangre y luego centrifugar a 5000 r.p.m. durante 5 minutos. Eliminar el plasma y lavar las células con solución salina isotónica (NaCl0.9% w/v). Las células se lisan adicionando 4 volúmenes de agua destilada (V/V). Para el ensayo, el stock de lisis se diluye 1: 500 con buffer fosfato salino ( pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0).

2. Medida...