Biblioteca dna

BIOT 3250
Bibliotecas de DNA, PCR y Secuenciación
Dra. Lizbeth Romero

Temas
• Identificación y clonación de gen de interés
– Bibliotecas genómicas – Bibliotecas de cDNA – Hibridación de colonias – PCR – Secuenciación

Bibliotecas de DNA
• Una biblioteca de DNA es una colección de fragmentos de DNA de un organismo particular clonados, contenidos en una bacteria o virus (hospedero) • Sepueden rastrear para seleccionar genes de interés • Existen dos tipos de bibliotecas:
– Genómicas – De DNA complementario (cDNA)

Bibliotecas de DNA
• Genómicas
– Colección de fragmentos que incluye todo el genoma de un organismo – DNA cromosomal del tejido de interés es aislado y digerido con enzimas de restricción – Un vector es digerido con la misma enzima – Se utiliza DNA ligasa paraunir los fragmentos de DNA cromosomal y el vector – Bacterias (organismo hospedero) son transformadas con los vectores recombinantes

Bibliotecas de DNA
• Para construir la biblioteca genómica primero se corta el genoma • Se utilizan enzimas de restricción como Sau3a • También se pueden utilizar métodos mecánicos (mechanical shearing) como la ultrasonicación que emplea ondas de sonido,vibraciones/segundo

Bibliotecas de DNA
• Con la digestión parcial se obtienen un sin número de fragmentos aleatorios, solapados (con zonas en común, contiguos) y de diferentes tamaño • Una vez digeridos se corre una electroforesis para separar los fragmentos por tamaño, se extraen del gel de agarosa y se acomodan en el vector de selección

Electroforesis de DNA
• Electroforesis de agarosa
–Agarosa es una matriz que se utiliza para generar un gel poroso a través de los cuales viajan fragmentos de DNA – El porciento de agarosa que se utiliza para preparar el gel determina el tamaño de los poros y el tamaño de los fragmento de DNA que puede separar
• Geles comunes utilizan 0.5–2% agarosa • Mayor porciento menor tamaño de poro • Menor porciento mayor tamaño de poro

Electroforesis de DNA• Electroforesis de agarosa
– Para una corrida se sumerge el gel en un amortiguador (buffer) que conduce electricidad – El DNA se coloca en fosas en el gel – Corriente es aplicada a los terminales del gel
• El DNA migra de acuerdo a tamaño y carga • La razón de migración depende del tamaño del fragmento
– Fragmentos grandes migran lento; fragmentos pequeños migran mas rápidoElectroforesis de DNA
• Electroforesis de agarosa
– Se añade a las muestras un tinte de rastreo para monitorear la migración del DNA durante la electroforesis – Luego de la electroforesis se puede visualizar los fragmento de DNA utilizando tintes como bromuro de etidio

Electroforesis de DNA

Bibliotecas de DNA
• Si las condiciones son adecuadas, solamente un fragmento del genoma será insertado alvector. • Se introduce el vector recombinante con el fragmento a la bacteria. • Se monitorea para identificar aquellos que tienen el fragmento o gen de interés.

Bibliotecas de DNA
• Para genomas pequeños como de bacterias (4.6 millones bp) se pueden utilizar como vectores plásmidos o Lambda • Para genomas grandes como de mamíferos (3000 millones bp) se utilizan vectores como cósmidos (32-45 kb),BAC (100-350kb) y YAC (600kb - 2 megabases) • Cuando se usan vectores que permiten insertar fragmentos grandes se requiere de menos clones para monitorear el gen o secuencia de interés

Bibliotecas de DNA
• Si se está utilizando un vector Lambda para construir la biblioteca del DNA humano se necesitan 500,000 clones • En cósmidos se requiere de 200,000 clones • YAC solamente se necesitan10,000 clones

Bibliotecas de DNA
• Múltiples insertos unidos pueden causar dificultad, ya que puede proveer información confusa sobre el genoma • Para evitar esto el inserto puede ser sometido a un tratamiento con fosfatasa alcalina en lugar del vector • Esto previene la ligación de un inserto con otro y asegura que todos los vectores recombinantes tengan un solo fragmento

Bibliotecas de...