bio quimica
Páginas: 11 (2626 palabras)
Publicado: 2 de febrero de 2014
Universidad de Chile Ingeniería Civil
F. Ciencias Físicas y Matemáticas en Biotecnología
INTA
Bioquímica General
(BT35A)
Guía de Trabajos Prácticos
Purificación y Caracterización de
Fosfatasa Alcalina
Juan Pablo Rodríguez
Luis Pastenes O.
2007
INTRODUCCIÓN
A. Purificación de Proteínas.
Lascélulas contienen cientos de proteínas diferentes, por lo tanto, para estudiar las características de una proteína en particular es esencial tener una preparación pura de dicha proteína.
¿Cómo se puede purificar una proteína?
Los diferentes métodos de purificación toman en cuenta las características de las proteínas tales como carga, tamaño y solubilidad, las cuales varían de una proteínaa otra.
Las fuentes de proteínas son generalmente un tejido o células de origen microbiano. Por lo tanto, el primer paso consiste en romper las células para liberar las proteínas al medio y obtener de esta manera el extracto crudo. Si fuera necesario este extracto se puede separar de organelos y restos celulares mediante una centrifugación diferencial.
Una vez que el extracto está separadoexisten una serie de métodos disponibles para la separación de proteínas. La cromatografía de intercambio iónico puede ser utilizada para separar proteínas que tengan diferente carga. Otros métodos cromatográficos (exclusión en gel, cromatografía de afinidad) utilizan la diferencia de tamaño o de afinidad de unión para separar proteínas. También existen los métodos no cromatográficos, entre losque se incluyen la precipitación selectiva de proteínas por: sal, ácidos, solventes orgánicos o altas temperaturas.
En la mayoría de los casos, para obtener una preparación pura de la proteína se deben usar varios métodos de purificación en forma secuencial. La elección de los métodos a usar son generalmente empíricos y se deben probar diferentes protocolos hasta encontrar el más indicado.Para purificar una proteína es necesario disponer de un ensayo para detectar y cuantificar la proteína en presencia de otras proteínas. Para el caso de una enzima, ésta puede ser detectada y cuantificada midiendo la reacción química que cataliza. Por convención internacional, una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima que produce la transformacion de 1 mol de sustrato en producto porminuto a 25ºC. El término actividad se refiere al total de unidades de enzima presentes en la solución. El término actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteínas. La actividad específica es una medida de la pureza de la enzima: ésta aumenta durante la purificación de la enzima y llega a ser máxima y constante cuando la enzima está pura.
Para proteínas que noson enzimas se deben encontrar otros métodos de cuantificación: la capacidad que tengan de unir moléculas, el efecto biológico que ellas producen, etc.
En estos trabajos prácticos se analizarán las características cinéticas de la enzima fosfatasa alcalina, para lo cual es necesario tener una preparación pura de la enzima. Para su purificación se utilizan los siguientes métodos deseparación:
a) Precipitación por sal.
La solubilidad de las proteínas disminuye frente a elevadas concentraciones de sal. Este efecto, producto del aumento de la fuerza iónica, aunque no está bien comprendido es muy utilizado, debido a que la solubilidad respecto a la concentración de sal difiere de una proteína a otra. Por lo tanto, es posible separar diferencialmente proteínas, desde unamezcla, por precipitación modificando gradualmente la concentración de sal. La sal más utilizada es el sulfato de amonio: (NH4) 2 SO4.
b) Cromatografía de exclusión molecular o de filtración en gel.
Las proteínas pueden ser separadas también aprovechando sus distintos tamaños moleculares. Para ésto, la muestra se aplica en una columna gel compuesto por esferas de un polímero insoluble (fase...
Universidad de Chile Ingeniería Civil
F. Ciencias Físicas y Matemáticas en Biotecnología
INTA
Bioquímica General
(BT35A)
Guía de Trabajos Prácticos
Purificación y Caracterización de
Fosfatasa Alcalina
Juan Pablo Rodríguez
Luis Pastenes O.
2007
INTRODUCCIÓN
A. Purificación de Proteínas.
Lascélulas contienen cientos de proteínas diferentes, por lo tanto, para estudiar las características de una proteína en particular es esencial tener una preparación pura de dicha proteína.
¿Cómo se puede purificar una proteína?
Los diferentes métodos de purificación toman en cuenta las características de las proteínas tales como carga, tamaño y solubilidad, las cuales varían de una proteínaa otra.
Las fuentes de proteínas son generalmente un tejido o células de origen microbiano. Por lo tanto, el primer paso consiste en romper las células para liberar las proteínas al medio y obtener de esta manera el extracto crudo. Si fuera necesario este extracto se puede separar de organelos y restos celulares mediante una centrifugación diferencial.
Una vez que el extracto está separadoexisten una serie de métodos disponibles para la separación de proteínas. La cromatografía de intercambio iónico puede ser utilizada para separar proteínas que tengan diferente carga. Otros métodos cromatográficos (exclusión en gel, cromatografía de afinidad) utilizan la diferencia de tamaño o de afinidad de unión para separar proteínas. También existen los métodos no cromatográficos, entre losque se incluyen la precipitación selectiva de proteínas por: sal, ácidos, solventes orgánicos o altas temperaturas.
En la mayoría de los casos, para obtener una preparación pura de la proteína se deben usar varios métodos de purificación en forma secuencial. La elección de los métodos a usar son generalmente empíricos y se deben probar diferentes protocolos hasta encontrar el más indicado.Para purificar una proteína es necesario disponer de un ensayo para detectar y cuantificar la proteína en presencia de otras proteínas. Para el caso de una enzima, ésta puede ser detectada y cuantificada midiendo la reacción química que cataliza. Por convención internacional, una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima que produce la transformacion de 1 mol de sustrato en producto porminuto a 25ºC. El término actividad se refiere al total de unidades de enzima presentes en la solución. El término actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteínas. La actividad específica es una medida de la pureza de la enzima: ésta aumenta durante la purificación de la enzima y llega a ser máxima y constante cuando la enzima está pura.
Para proteínas que noson enzimas se deben encontrar otros métodos de cuantificación: la capacidad que tengan de unir moléculas, el efecto biológico que ellas producen, etc.
En estos trabajos prácticos se analizarán las características cinéticas de la enzima fosfatasa alcalina, para lo cual es necesario tener una preparación pura de la enzima. Para su purificación se utilizan los siguientes métodos deseparación:
a) Precipitación por sal.
La solubilidad de las proteínas disminuye frente a elevadas concentraciones de sal. Este efecto, producto del aumento de la fuerza iónica, aunque no está bien comprendido es muy utilizado, debido a que la solubilidad respecto a la concentración de sal difiere de una proteína a otra. Por lo tanto, es posible separar diferencialmente proteínas, desde unamezcla, por precipitación modificando gradualmente la concentración de sal. La sal más utilizada es el sulfato de amonio: (NH4) 2 SO4.
b) Cromatografía de exclusión molecular o de filtración en gel.
Las proteínas pueden ser separadas también aprovechando sus distintos tamaños moleculares. Para ésto, la muestra se aplica en una columna gel compuesto por esferas de un polímero insoluble (fase...
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