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TILLING: Una herramienta de genética inversa y una colección web-accesible de la legumbre Lotus japonicus

La genética inversa apunta a identificar la función de un gen con una secuencia conocida por análisis de células u organismos, en que la función de ese gen es dañado. Comúnmente usando estrategias de genéticas inversas abarcando mutagénesis de transposón y gen silencioso de ARN-medio o ARNde interferencia.

Debido a todo esto se adoptó una estrategia complementaria para establecer una herramienta de genéticas inversas para la legumbre Lotus japonicus, identificando individuos que lleven mutaciones puntuales en algún gen de interés dentro de la gran población de plantas M2 de EMS mutagenizado, la cual fue descrita en el 2000 e identificada con el acróstico TILLING.
Lasecuencia objetiva es amplificada con PCR de individuos M2 reunidos. El DNA con mutaciones puntuales fueron detectadas por fusión y realineamiento de los productos PCR. Estos resultados se dan de la formación de DNA heterodúplex, entre la hebra original del mutante y del producto de tipo PCR silvestre. Una desigualdad ocurre en el mismo sitio de la mutación puntual, que puede ser detectada usandoendonucleasas de desigualdad específica como el CEL I del apio. Esta enzima reconoce desigualdades en DNA heterodúplex y DNA cortado en el sitio desigual. Los productos cortados pueden ser separados por electroforesis, por la típica desnaturalización de tipo secuenciación PAGE. Este método de detección de desiguales es responsable de estrategias de agrupación. Una población de 68 individuospuede ser investigada por PCR por microtitulación de plata, y corrido electroforético, donde cada muestra en los pocillos, representaba 8 individuos. Los individuos de productos cortados de rendimiento juntados son entonces amplificados individualmente en PCR para identificar la mutación de corrimiento plantar de la progenie que segregará la mutación de interés. A pesar de que el TILLING de altorendimiento, fácilmente ha sido establecido sucesivamente para Arabidopsis, ciertos aspectos de biología plantar, no pueden ser estudiados en esta planta, como por ejemplo, la simbiosis de la raíz de rizomas y micorrizas fungi, el desarrollo del crecimiento de la hoja, así como aspectos del desarrollo floral. El genoma de esta planta es como tema de proyecto de secuenciación, ya que un problemaasociado con mutagénesis EMS es la frecuencia alta de infertilidad de plantas no únicamente en las M1 sino también en las generaciones subsecuentes. El objetivo de está investigación fue ensamblar una población general de TILLING que idealmente podría ser compuesta de solo individuos fértiles, para que la progenie de una planta transportadora de alelo mutante pueda ser directamente recuperada. Unapoblación general de TILLING de 3697 plantas M2 independientes, fue predisponiblemente establecida contra la ocurrencia de varios fenotipos desarrollados a aumentar al máximo la disponibilidad de semillas M3.
Una ventaja específica de mutagénesis EMS, es que una serie de mutaciones alélicas pueden ser obtenidas mostrando un rango de fenotipos que pueden servir como base de estudios funcionales deestructura detallada. Esto también tiene el potencial de recuperar alelos débiles con cambios sutiles en genes funcionales, que pueden ser letales cuando más fuertemente son afectadas. Sin embargo, la recuperación de alelos fuertemente afectados o knock-out serán de principal interés en especies, como una herramienta de mutagénesis de inserción no knock-out establecida.

Al enriquecer laresistencia de plantas funcionalmente dañadas, con alelos de genes mutantes involucrados en una variedad de procesos de desarrollo y metabolismo, se marcaron aproximadamente 45600 progenies M2 de 4190 plantas M1 EMS mutagenizadas y mutantes aisladas, que afectan en la morfología metabólica y simbiosis de la raíz nodular.

Un piloto experimental fue realizado en el gen SYMRK, el cual fue sometido al...