Biologia Seminario 13

1. Explique la técnica PCR (Reacción en cadena de polimerasa). Aplicaciones en medicina.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica "in vitro" que imita la habilidad natural de la célula de duplicar el ADN, en unas pocas horas y sin necesidad de usar células vivas
Se trata de una técnica usada para crear un gran número de copias de un segmento de ADN, que utiliza ciclosde desnaturalización, apareamiento con cebadores y extensión por una ADN polimerasa termoresistente.
En el año 1985 fue desarrollado por el investigador norteamericano, Kary Mullis (acreedor del Premio Nobel en Química 1993 por este aporte)
Esta técnica, requiere conocer la secuencia de nucleótidos de los extremos del fragmento que se quiere amplificar. Estas secuencias se usan paradiseñar dos oligonucleótidos sintéticos de ADN complementarios a una porción de cada una de las dos cadena de la doble hélice.
1. Proceso:
La mezcla de reacción contiene la secuencia de DNA que se quiere amplificar, dos oligonucleótidos sintéticos (P1 y P2) que servirán como cebadores, una DNA polimerasa termoestable (Taq) y los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato –dATP, dGTP, dCTPy dTTP–.
La mezcla de reacción se somete a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a una fase de desnaturalización, una de hibridación o alineación y una de elongación.
a) Durante la desnaturalización, que se realiza por calentamiento de la mezcla a 95ºC, se separan las dos cadenas del ADN molde.
b) Durante la hibridación, la temperatura de incubación se reduce para permitir elapareamiento de las bases de ambos cebadores en el sitio donde encuentran una secuencia
c) Durante la fase de elongación, la mezcla se calienta a 72ºC y la enzima Taq ADN polimerasa se usa para replicar las hebras de DNA. La Taq polimerasa comienza el proceso de extensión de la cadena complementaria a partir del extremo 3’ de los cebadores. Al finalizar cada ciclo, la cantidad de ADN moldedisponible para el ciclo siguiente aumenta al doble.
 PCR a partir de ARN.
El genoma de muchos virus de importancia clínica está compuesto de ARN en lugar de ADN, los más sobresalientes son el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), el Virus de la Hepatitis C (HCV) y la familia de Enterovirus (EV).
Transcripción Reversa- PCR (RT-PCR).
Dado que el ARN usualmente es de una sola hebray es sensible al calor, es necesario hacer una transcripción reversa (RT) antes de iniciar la amplificación por PCR. La transcripción reversa genera una copia de la hebra de RNA, pero esta copia es ADN complementario (cADN) el cual es estable al calor y puede resistir la metodología PCR.
Los pasos de la RT-PCR son:
1. Transcripción reversa: Unión del partidor a la secuencia de ARNobjetivo.
2. Transcripción reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensión del partidor mediante la incorporación de nucleótidos complementarios.
3. Fin de transcripción reversa, se obtiene la hebra del cADN complementario al ARN.
4. PCR
Aplicaciones en la medicina
Entre muchas de las aplicaciones que la PCR pone a disposición se encuentran la detección precoz o prenatalde enfermedades genéticas familiares como la fibrosis quística, la distrofia muscular de Duchenne y otras muchas, asi como también es aplica para estudios de identidad y filiación, Oncología, la detección de translocaciones, mutaciones, deleciones, etc. No obstante, la aplicación de esta técnica es el uso fundamental en el campo de enfermedades infecciosas en sus distintos aspectos. LaPCR ha ayudado a establecer el pronóstico de distintas infecciones por medio de la determinación cuali/cuantitativa del virus de la hepatitis C o por medio de la determinación de la viremia plasmática en la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana, en la que está reconocida la importancia de la determinación de la carga vírica en sangre en el pronóstico de la infección....