Biologia

Extracción de DNA- “Salting Out”
1. Sacar sangre periférica de individuo.
2. Colocar 5ml. de sangre con un anticoagulante EDTA en un tubo Falcon y agregar 20 ml. de la solución para lisis deeritrocitos.
a. El anticoagulante actúa como un agente quelante (forma enlaces con iones de metales pesados), lo que impide que haya coagulación sanguínea. Es una buena opción porque no altera lamorfología de los eritrocitos y leucocitos.
b. Se le agrega la solución de lisis de eritrocitos, ya que nuestro interés (DNA) se encuentra en los glóbulos blancos (leucocitos) y nos queremos deshacer de todolo demás, es decir, de los eritrocitos (glóbulos rojos-carecen de núcleo y mitocondria-hemoglobina).
3. Introducir la muestra al congelador por 5 min. Y consecutivamente 10 min al refrigerador,mezclando suavemente cada 3 min. Centrifugar 10 min. A 8000 rpm
a. La temperatura fría ayuda a que la solución de lisis de eritrocitos penetre a los glóbulos rojos y los hinche.
b. Después delenfriamiento, ya que la solución ya está dentro de los eritrocitos, se mete a centrifugar y así se rompen finalmente los glóbulos rojos y se lleva a la lisis completa de estos.
4. Eliminar el sobrenadantecon mucho cuidado para no tocar la pastilla de leucocitos formada, y agregar 10 ml. de solución para lisis de eritrocitos, dejar aprox. 5 min en el congelador y volver a centrifugar por 10 min a8000rpm.
a. Se vuelve a agregar la lisis de eritrocitos ya que se quieren eliminar por completo. Se formó una pastilla de leucocitos al fondo del tubo, ya que son los que no se están eliminando y sequieren conservar.
5. Eliminar el sobrenadante, y se lava la pastilla en solución de lisis para eritrocitos, se quita el sobrenadante con pipeta Pasteur y se deja solamente la pastilla de leucocitos.
a.De igual manera es para acabar finalmente con todos los eritrocitos.
6. Se le agrega 3 ml. de buffer de lisis de leucocitos, 200microlitros de SDS, y 60 micro litros de proteinasa K, se incuba por...