biologia

Los contaminantes más frecuentes de los cultivos de células animales son los micoplasmas. Conforme a las proyecciones recientes, alrededor del 35% de todos los cultivos de células están contaminadas con micoplasmas. Debido a su tamaño y la falta de una pared celular bacteriana, micoplasmas son capaces de pasar a través de Filtros de 0,2 micras de uso común para la filtración estéril de loscomponentes de los medios de comunicación y los medios de comunicación.
Micoplasmas no pueden ser detectados por el microscopio de luz. A diferencia de las bacterias la contaminación, infección por micoplasma no causa turbidez en el medio de cultivo celular, incluso si las densidades de crecimiento del 108 partículas / ml se alcanzan. Otra característica destacada de los micoplasmas es su resistenciaa varios antibióticos utilizados para la prevención de la contaminación bacteriana en el cultivo celular.
Una serie de parámetros fisiológicos y bioquímicos se ven afectados por la presencia de
micoplasmas en cultivos celulares. Los micoplasmas se sabe que inducen inestabilidad cromosómica en células de mamíferos y para inhibir el crecimiento celular. Además, micoplasmas interferir con variosensayos bioquímicos, tales como los ensayos de la transcriptasa inversa, así como los ensayos de proliferación basado en la incorporación de timidina. Teniendo en cuenta estos hechos, un confiable sensible, y el diagnóstico de micoplasmas regular es recomendable para los laboratorios de manipular cultivos de células animales.
Existen varios métodos para la detección de las cinco especies demicoplasmas más
se encuentran comúnmente en el cultivo de células de mamíferos (fermentans M., M. hyorhinis, M. orale, M. arginini, A. laidlawii, ver las referencias 2,3). Estos métodos se basan en microbiológicos la cultura, la tinción de ADN con colorantes fluorescentes, inmunounión, enzimática o serológica pruebas, ELISA, y / o PCR. Los métodos de detección difieren con respecto a la facilidad dedetección, velocidad, sensibilidad y especificidad.
Hemos probado un Boehringer Mannheim radiactivo PCR método ELISA para la
la detección de micoplasmas típico de la cultura de células de mamíferos. El método se deriva de una "PCR anidada" de detección del método que se ha establecido previamente. El Boehringer Mannheim Mycoplasma PCR ELISA evita los esfuerzos, son necesarios para prevenir arrastrede contaminación causada por el segundo paso de PCR, ELISA PCR permite una PCR PasoAPaso en el que se introduce una etiqueta digoxigenina, seguido por la detección digoxigenina.
Materiales y Métodos
Tampones y reactivos de Boehringer Mannheim Mycoplasma PCR ELISA se utilizaron
tal como se suministra con el kit.
Muestra una preparación
Los micoplasmas se cultivaron, y se aisló elADN esencialmente como se describe en la referencia 4.
Muestra 2 preparaciones
Sobrenadantes de las células animales se centrifugaron durante 10 minutos a 13.000 x g y 4 ° C. Sobrenadantes fueron cuidadosamente removidos, y 10 µl de agua estéril y 10 µl de lisis reactivos se han añadido a la pastilla, que era invisible en algunos casos. Después de 1 h de incubación a 37 ° C, 30 µl de reactivode neutralización se añadió.
Amplificación
En un tubo de PCR, 10 µl de la muestra se mesclo con 15 µl de agua estéril y 25 µl de la mezcla lista para el uso de PCR maestro. Después de una pre-incubación durante 5 minutos a 95 ° C, DNA fue amplificado en termocicladores 480 y 9600 (Perkin Elmer) por 40 PCR ciclos (separación de cadena, 30 segundos a 94 ° C;
recocido, 30 segundos a 62 ° C, elongación, 1 min a 72º C) seguido por una elongación final de 10 minutos a 72 ° C.

Detección
Diez microlitros de la muestra se incubó con 40 ml de reactivo dedesnaturalización durante 10 min a temperatura ambiente. Reactivo de hibridación (450 µl), preparado como descrito por Boehringer Mannheim, fue añadido, y 200 muestras de l fueron trasladados a microtitulación recubiertos de estreptavidina platos,...