Bioq

PRÁCTICO 8-9 Electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%, con tinción Nitrato de plata

Integrantes:

Docentes:

Felipe Cayumil del Pozo, PhD Jaime Hernández Grandón Karol González Muñoz Javiera León Rotter Patricia Lobos Mitchel Manterola

Dr. Reginaldo Bq. Javier Bq. Mirna QA. Germán

Muestra problema n°2

Fecha de realización: 19/08/2009 24/09/2009 26/08/2009

Fecha deentrega:

Introducción

Dentro de las técnicas de laboratorio utilizadas con mayor frecuencia, se encuentra la electroforesis, técnica basada en la utilización de una corriente eléctrica, controlada a diferentes voltajes con el fin de lograr la separación de biomoléculas. La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en papel o en acetatode celulosa), o bien a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa. Esta técnica fue inventada por el bioquímico sueco Arne Wilhelm Kaurin Tiselius, quien sometió a corriente eléctrica en un tubo de cuarzo unasolución proteica y observó que en el tubo se diferenciaban distintas bandas, de distintos grosores. En ese momento no utilizo ningún tipo de soporte, pero más adelante se descubriría que al utilizar soporte se notan zonas mucho mas delimitadas. Actualmente los instrumentos utilizados para la realización de esta técnica bioquímica son primero una fuente de tensión la que realizara los cambios devoltaje para que corra la muestra, electrodos, cubetas, un soporte electroforético y un tampón. La existencia de distintos tipos de soportes nos posibilita a clasificar las electroforesis dentro de 2 grandes grupos, dependiendo de la ausencia o presencia de impedimento al paso de moléculas. Si no oponen resistencia, es un soporte no restrictivo y si lo hace hablaríamos de un soporte restrictivo.Dentro del grupo de soportes restrictivos, el más representante de estos por excelencia es la electroforesis en gel de poliacrilamida, una de las más utilizadas para la caracterización de mezclas proteicas de gran complejidad, lo cual se debe a sus múltiples ventajas. Es rápido, se necesita poca muestra para poder analizar, el gel es químicamente inerte, es transparente, por lo que facilita lavisibilidad de las bandas, el gel también es resistente a agentes desnaturalizantes como la urea y detergentes, mecánicamente son estables, lo que posibilita su deshidratación para reducirlos a una capa fina que facilita su almacenamiento, también son estable a variados pH y a temperaturas variadas. En el práctico utilizamos el método electroforético en gel de poliacrilamida. El proceso deseparación de este gel se basa en la porosidad del mismo, el cual obtuvimos mezclando distintas concentraciones de poliacrilamida y bisacrilamida (dependiendo de el porcentaje que buscábamos, en nuestro caso de 12%) siendo menor el poro cuanta más bis-acrilamida usemos en comparación a ala archilamida. También se puede controlar los tamaños de los poros variando los tiempos de polimerización. Estapolimerización se lleva a cabo iniciando un sistema generalizador de radicales libres, se comienza con la adición de TEMED (tetrametiletilendiamina) y persulfato de amonio. TEMED acelera la velocidad de formación de radicales libres a partir del persulfato, estos radicales libres convierte a los monómeros de acrilamida en radicales libres que activan a otros monómeros iniciando la polimerización, losenlaces entrecruzados están dados por la polimerización de la bis-acrilamida es por eso que cuanto más concentración de bisacrilamida adicionemos menor será el tamaño del poro. Esta técnica se combina con la adición a la muestra de sodio dodecil sulfato (SDS) el cual es un detergente que se une a las proteínas proporcional a la masa molecular de estas, las somete a desnaturalización, cargándolas...