Bioquimica practica 1

Práctica 1: Métodos para la cuantificación de proteínas.


Introducción

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchospropósitos.

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, para la formación de derivados químicos, o la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.
Los métodos más utilizados para la determinación de proteínas son:

Método del Biuret.
Reacción deFolin-Ciocalteau (Método de Lowry)
Reacción de “Comassie-Brillan Blue” (Método de Bradford)
Determinaciones turbidimétricas
Determinaciones espectrofotométricas (Método de Warburg-Christian)
En esta práctica vamos a utilizar el método de Biuret, y el método de Bradford.


Objetivo

En esta práctica se utilizaran dos métodos para la cuantificación de proteínas: Biuret y Bradford. Para cada uno delos métodos se realizaran: una curva estándar, la cuantificación de muestras problemas y el rango de sensibilidad.
Método de Biuret
Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y lareacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).
Materiales:
Pipetas.
Tubos de ensayo.
Espectrofotómetro.
Incubadora.
Agitador.

Reactivos:
Reactivo de Biuret: Pesar 1,50 g de CuSO4·5H2O; 6,00 g de tartratosódicopotásico (NaKC4O6·4H2O)4 y disolverlos en 500 ml de agua destilada. Mientras se agita la mezcla anterior se añaden 300 ml de NaOH al 10% (p/v), llevándose el volumen final a 1 litro con agua destilada.
Solución de seroalbúmina bovina (SAB) de 10.000 ppm en NaCl 0,15 N.
Solución de SAB de 3000 ppm (M1) y 100 ppm (M2).
Leche.
Protocolo experimental:
Muestra L1: 0,1ml de leche con 4,9 ml de H2O.Muestra L2: 0,1ml de L1 y 4,9 ml de H2O.
Rotulamos los tubos de plástico del 1 al 15 y preparamos los tubos de la curva patrón de albúmina del 1 al 5, según la siguiente tabla:

Tubo
SAB 10000ppm (ml)
Agua(ml)
1
0
0,5
2
0,1
0,4
3
0,2
0,3
4
0,3
0,2
5
0,4
0,1

En los tubos del 6 al 13 añadimos 0.5ml de las muestras M1 (solución estándar de proteínas de 3000ppm), M2 (soluciónestándar de proteínas de 100ppm), L1 y L2 por duplicado , de la siguiente manera:
Tubo
M1 3000ppm (ml)
6
0,5
7
0,5
Tubo
M2 100ppm (ml)
8
0,5
9
0,5
Tubo
L1
10
0,5
11
0,5
Tubo
L2
12
0,5
13
0,5

Para conocer si interfieren en la determinación de proteínas compuestos como el EDTA o el SDS preparamos otros dos tubos mediante la siguiente tabla:

Tubo
SAB 10000ppm (ml)
Agua (ml)EDTA 1M (ml)
SDS 20% (ml)
14
0,2
0,25
0,05
---
15
0,2
0,25
---
0,05


Una vez estén preparados todos los tubos añadir 5 ml del reactivo de biuret en todos los tubos.
Agitamos bien los tubos para conseguir una completa mezcla de los reactivos.
Ponemos a incubar los tubos durante 30 minutos con una temperatura de 37ºC.
Una vez terminado el tiempo de incubación sacamos los tubos dela incubadora y medimos la absorbancia de cada uno de ellos a 540nm en el espectrofotómetro.

Método de Bradford
Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de...