Bradford

PRÁCTICA 4

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
(MÉTODO DE BRADFORD)

INTRODUCCIÓN

La concentración total de proteínas puede estimarse de acuerdo al contenido de nitrógeno total de una muestra,que es lo que se estima con el método de Kjeldhal por ejemplo. Sin embargo, existen métodos a través de los cuales se detecta la presencia de ciertos grupos químicos presentes en las cadenas lateralesde algunos aminoácidos en particular.

Entre los métodos de cuantificación más utilizados están los análisis colorimétricos ya que proporcionan una alta precisión dependiendo del cuidado que setenga en la preparación de las muestras y principalmente los controles, en este sentido los métodos de Biuret y de Lowry son los más utilizados. El método de Bradford es muy utilizado debido a susencillez y a su sensibilidad para detectar cantidades de entre 1 y 1500 g de proteínas totales, este método se basa en el empleo del colorante azul brillante de Coomassie G250 (figura 1), las moléculas delcolorante contienen dos grupos fenilo y dos grupos de ácido sulfónico, así que las interacciones son débiles (no covalentes) y ocurren de manera hidrofóbica con los aminoácidos hidrofóbicos(Triptofano, Tirosina, Histidina y Fenilalanina) y de manera electrostática con Arginina y Lisina; con estas uniones se produce una mezcla de color azul cuyo máximo de absorción es a los 595 nm.

El métodode Bradford es conveniente cuando en no se emplean detergentes en el aislamiento de las proteínas, muchas sustancias químicas empleadas con este fin (sacarosa, urea o glicerol) no interfieren con laslecturas de absorbancia final; sin embargo, cuando se emplean detergentes como SDS (dodecil sulfato de sodio) o Triton, los valores de absorbancia finales pueden ser más elevados. El exceso dedetergente interactúa hidrofóbicamente con el colorante y causa una sobreestimación en la cantidad de proteínas presentes en la muestra. También se pueden tener interferencias similares con lípidos o...