Lowry Bradford

Determinación de proteínas por los métodos de lowry y bradford

Objetivos:

• Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico
• Determinar di hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y la exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry
• Conocer el efecto de sustancias no proteinitas en el desarrollo decolor
• Analizar las ventajas y desventajas del método de Lowry, con respecto a otros métodos para la cuantificación de proteínas

Fundamento:

Con el método de Bradford las proteínas tienen una capacidad de absorción máxima de 465 eso cambia a 595 nm cuando el colorante esta unido a las proteínas. Este es el principio básico del azul de Coomasie)
El método de Lowry tiene dos partes lascuales son: 1.-Reacción previa de la proteína en medio alcalino con iones Cu2+, en presencia de tartrato para evitar la precipitación. Es esencialmente idéntica a la reacción del Biuret, formándose un complejo de coordinación entre el cobre y el nitrógeno peptídico.
2.-Reacción con el reactivo de Folin-Ciocalteau para fenoles (ácido fosfomolibdotungstico), que se reduce por medio de los gruposfenol (y en menor medida imidazol e indol) presentes en la proteína a un complejo de color azul oscuro, que se mide colorimétricamente. El complejo coloreado, cuya composición es desconocida, presenta dos máximos de absorción a las longitudes de onda de 560 y 680 nm. La elección de una u otra depende de la concentración proteica de la muestra estudiada.
Las formulas a utilizar para la comparaciónde los métodos son:
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Resultados:

Tabla 1. Curva de calibración de albúmina. Método de Lowry.

|Tubo |Cantidad de |A 590 |Serie ajustada por regresión |
| |proteína μg | |lineal |
| | |serie a |serie b | |
|1 |25|0,071 |0,048 |0,05055 |
|2 |50 |0,103 |0,103 |0,1021 |
|3 |75 |0,134 |0,129 |0,15365 |
|4 |100 |0,215 |0,208 |0,2052 |
|5 |125 |0,261 |0,265|0,25675 |

Tabla 2. Curva de calibración de albúmina. Método de Bradford.

|Tubo |Cantidad de proteína|A 595 |Serie ajustada por regresión |
| |μg | |lineal |
| | |serie a |serie b | |
|1 |25|0,179 |0,228 |0,2223 |
|2 |50 |0,348 |0,372 |0,33585 |
|3 |75 |0,467 |0,48 |0,4494 |
|4 |100 |0,531 |0,504 |0,56295 |
|5 |125 |0,662|0,723 |0,6765 |

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Grafica 1. Muestra las curvas de calibración de los dos métodos.

Preguntas:

a) Calcule y escriba los valores de la pendiente, ordenada al origen y el coeficiente de correlación.


Tabla 3. Valores de la ecuación de la recta


|Método |m |b |r|Ecuación de la recta |
|Lowry |2,052x10-3 |-9,5x10-4 |0,9851 |y=2,052x10-3x-9,5x10-4 |
|Bradford |4,54x10-3 |0,1087 |0,9784 |y=4,54x10-3x+0,1087 |
|Fórmula |(y2-y1) |b= y-mx |[pic]...