Caracterización cinética de la Arginasa recombinante de hígado humano y análisis de los efectos de diferentes factores que influyen en su actividad enzimática

Caracterización cinética de la Arginasa recombinante de hígado humano y análisis de los efectos de
diferentes factores que influyen en su actividad enzimática

Caracterización cinética de la Arginasa recombinante de
hígado humano y análisis de los efectos de diferentes
factores que influyen en su actividad enzimática


RESUMEN
En el presente trabajo se hizo un estudio de la enzimaArginasa tipo I, la cual hidroliza
arginina produciendo urea y ornitina. Esta enzima requiere iones metálicos para su
actividad, especialmente manganeso. Para su estudio, se realizaron numerosas
pruebas, lo que nos permitió determinar la concentración de Arginasa de nuestra
muestra y entender el comportamiento de la enzima, realizando curvas de progreso, de
saturación, de calibración con soluciónstandard de albumina de suero bovino y
además gráficas de actividad frente a distintos factores, para así poder determinar
condiciones óptimas de reacción. Se evidenció que la Arginasa presenta una mayor
actividad en presencia de manganeso, así como también se concluyó que su pH óptimo
oscila alrededor de 8,5 y 10,5, es decir, en un medio básico.
Palabras claves: Arginasa, arginina,inhibidores, cofactores, saturación, parámetros
cinéticos.
INTRODUCCIÓN
ornitina y urea.[1] El sitio activo de la
Arginasa, sostiene L-arginina en su
lugar, a través de enlaces de hidrógeno
entre el grupo guanidinio y Glu227,
orientando la unión de L-arginina para
el ataque nucleofílico. El sitio activo de
la Arginasa es extraordinariamente
específico. La modificación severa de la
estructura delsustrato y / o de su
estereoquímica, disminuye la actividad
cinética de la enzima. Esta especificidad
se produce debido al elevado número de
enlaces de hidrógeno entre el sustrato y
la enzima, que son enlaces de hidrógeno
directos o facilitados por agua,
saturando tanto las cuatro posiciones
aceptor en el grupo alfa carboxilato
como las tres posiciones sobre el grupo
amino alfa.[2]

Laenzima Arginasa se encuentra
sólo en los organismos ureotélicos y
desempeña un rol fundamental en la
síntesis de urea en el hígado. Esta
enzima cataliza el quinto y último paso
en el ciclo de la urea, una serie de
reacciones bioquímicas en mamíferos,
durante el cual, el cuerpo elimina el
amoníaco. La Arginasa convierte la Larginina en L-ornitina y urea. [3] Esta
enzima consta de trestetrámeros. Con el
fin
de
mantener
su
correcto
funcionamiento, se requiere de un grupo
metálico de manganeso como cofactor.
Los iones de Mn+2 coordinan con agua,
para orientar y estabilizar la arginina,
esto hace posible que el agua actúe
como nucleófilo y
ataque a la Larginina, hidrolizándola para formar
1

Caracterización cinética de la Arginasa recombinante de hígado humano yanálisis de los efectos de
diferentes factores que influyen en su actividad enzimática

MATERIALES Y METODOS

Dilución de Arginasa
Se nos entregó una muestra de
Arginasa 1:50, la cual fue necesaria
diluir durante el trabajo. Para conseguir
Arginasa 1:500, se tomaron 100 µl de
Arginasa 1:50 y se llevó a un volumen
final de 1000 µl con TRIS 10 mM pH
7,5; para conseguir Arginasa 1:800 setomaron 65.6 µl de Arginasa 1:50 y se
llevó a un volumen final de 1000 µl con
TRIS 10 mM pH 7,5; para conseguir
Arginasa 1:1000 se tomaron 50 µl de
Arginasa 1:50 y se llevó a un volumen
final de 1000 µl con TRIS 10 mM pH
7,5.

Materiales Generales:
Espectrofotómetro,
Placa
calefactora, Mechero, gradilla y olla
para baño María, Vórtex, Tubos de
ensayo, Tubos eppendorf, Micropipetas,Bolitas de vidrio, Guantes de látex.
*(obtenidos en Sigma-Aldrich Chile)

Preparación de Arginasa
recombinante
Reactivos
utilizados:
TB
(Terrific Broth), LB (Luria Broth),
IPTG 0,5 mM, TRIS 10 mM pH 7,5;
tampón de Lisis: Tris 50 mM (pH 7,5),
KCl 100 mM, Ornitina 2 mM, MnCl2 5
mM. Al momento de usar se agregó
PMSF 0,1mM y DTT 2 mM.

Determinación de actividad enzimática
de la arginasa...