Catalasa
Páginas: 4 (813 palabras)
Publicado: 27 de noviembre de 2012
PRACTICA DE BIOQUÍMICA. CINÉTICA ENZIMÁTICA
Introducción:
Una forma de medir la actividad de la catalasa, es colocarla en presencia del sustrato un tiempo determinado, luego detener lareacción por desnaturalización y finalmente cuantificar el sustrato residual. En la práctica a realizarse la acción de la enzima se detiene al agregar H2SO4 6N. La cuantificación del sustrato notransformado (residual) se medirá mediante titulación con permanganato de potasio de acuerdo a la siguiente reacción:
2 MnO4-- + 5 H2O2 + 6 H+ --------- 5O2 + 2 Mn+2 + 8 H2OMateriales y reactivos
- Centrígufa - Tubos de ensayo
- Tubos heparinizados - Erlenmeyers
- Jeringas - Pipetas graduadas
- Algodón - KMnO4 0.002 M
- Baño 95º C - H2SO4 6N
- Pipetasplásticas - KCN 0.5 M
- Cronómetro - Buffer fosfato
- Soporte universal 50 mM pH 7.0
- Pinza para bureta 50 mM pH 6.0
- Baño hielo 50 mM pH 8.0
- Buretas - Peróxidos de Hidrógeno 0.09M
La práctica debe realizarse a 4 º C, debido al elevado número de recambio de esta enzima durante un período de 7 minutos.
Procedimiento
1. Extracto Enzimático: En un tubo heparinizadocolocar 5 ml de sangre y luego centrifugar a 5000 r.p.m. durante 5 minutos. Eliminar el plasma y lavar las células con solución salina isotónica (NaCl 0.9% w/v). Las células se lisan adicionando 4volúmenes de agua destilada (V/V). Para el ensayo, el stock de lisis se diluye 1: 500 con buffer fosfato salino ( pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0).
2. Medida de la actividad enzimática:
NOTA: Es importanterecordar, que el ensayo debe realizarse a 4°C mientras la enzima esté en presencia del sustrato.
2.1 Marcar 12 tubos de ensayo como B 1, 2, 3,.......,11.
2.2 Tomar el tubo de ensayo marcado como No3 y agregar 10 ml del extracto enzimático (dilución 1:500 pH 7.0) y calentarlo durante 10 minutos a 92ºC.
2.3 El tubo B es el Blanco por lo tanto no se agrega enzima.
2.4 Agregar en orden...
Introducción:
Una forma de medir la actividad de la catalasa, es colocarla en presencia del sustrato un tiempo determinado, luego detener lareacción por desnaturalización y finalmente cuantificar el sustrato residual. En la práctica a realizarse la acción de la enzima se detiene al agregar H2SO4 6N. La cuantificación del sustrato notransformado (residual) se medirá mediante titulación con permanganato de potasio de acuerdo a la siguiente reacción:
2 MnO4-- + 5 H2O2 + 6 H+ --------- 5O2 + 2 Mn+2 + 8 H2OMateriales y reactivos
- Centrígufa - Tubos de ensayo
- Tubos heparinizados - Erlenmeyers
- Jeringas - Pipetas graduadas
- Algodón - KMnO4 0.002 M
- Baño 95º C - H2SO4 6N
- Pipetasplásticas - KCN 0.5 M
- Cronómetro - Buffer fosfato
- Soporte universal 50 mM pH 7.0
- Pinza para bureta 50 mM pH 6.0
- Baño hielo 50 mM pH 8.0
- Buretas - Peróxidos de Hidrógeno 0.09M
La práctica debe realizarse a 4 º C, debido al elevado número de recambio de esta enzima durante un período de 7 minutos.
Procedimiento
1. Extracto Enzimático: En un tubo heparinizadocolocar 5 ml de sangre y luego centrifugar a 5000 r.p.m. durante 5 minutos. Eliminar el plasma y lavar las células con solución salina isotónica (NaCl 0.9% w/v). Las células se lisan adicionando 4volúmenes de agua destilada (V/V). Para el ensayo, el stock de lisis se diluye 1: 500 con buffer fosfato salino ( pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0).
2. Medida de la actividad enzimática:
NOTA: Es importanterecordar, que el ensayo debe realizarse a 4°C mientras la enzima esté en presencia del sustrato.
2.1 Marcar 12 tubos de ensayo como B 1, 2, 3,.......,11.
2.2 Tomar el tubo de ensayo marcado como No3 y agregar 10 ml del extracto enzimático (dilución 1:500 pH 7.0) y calentarlo durante 10 minutos a 92ºC.
2.3 El tubo B es el Blanco por lo tanto no se agrega enzima.
2.4 Agregar en orden...
Leer documento completo
Regístrate para leer el documento completo.