ciencia

Práctica 2
Trasporte de Glucosa a través de membrana plasmática. Estudio del efecto de los inhibidores/desacoplantes de la cadena de transporte de electrones
Las levaduras Saccharomyces cerevisiae son organismos unicelulares que se dividen por gemación. En común con otras células eucariotas, las levaduras tienen un núcleo en donde reside la información genética de la célula , mitocondrias endonde se lleva a cabo la síntesis de ATP y un retículo endoplásmico y aparato de Golgi que se encargan de la síntesis de proteínas cuya localización final es la membrana plasmática o el exterior. Presentan una complejidad superior a las bacteria pero compartiendo con ellas muchas de sus ventajas técnicas, como la manipulación por ausencia total de patogenicidad .
A nivel de la membrana plasmática,las levaduras tienen una ATPasa de H+ que acopla la hidrólisis del ATP con el bombeo de protones hacia el exterior de la célula. Este complejo es semejante desde un punto de vista estructural y funcional a la Bomba de Na+/K+ de las células animales y, al igual que la bomba de sodio/potasio, se inhibe con concentraciones micromolares de vanadato. Como resultado de la actividad de la ATPasa de H+ enla levadura, se genera un gradiente electroquímico de protones que se utiliza para impulsar el transporte de nutrientes al interior de la célula, proceso catalizado por sistemas de transporte llamados simportadores o uniportadores.
La H+ -ATPasa es la responsable de la formación del gradiente electroquímico de la membrana plasmática. Su actividad correlaciona con el crecimiento celular y seactiva, principalmente, por glucosa. Para darse una idea de la importancia de esta enzima en la economía celular y en la energización de la membrana celular, basta decir que la ATPasa de H+ consume hasta un 25 % del ATP que se sintetiza en la célula.
Además de esta ATPasa de H+ de la membrana plasmática, las levaduras tienen otra bomba de protones en la membrana interna de las mitocondrias, la ATPsintasa, que se encarga de la síntesis del ATP. En contraste con la enzima de membrana plasmática, el flujo de protones a través de la ATP sintasa induce la síntesis de ATP. Uno de los inhibidores más efectivos de esta enzima es la oligomicina.
De esta manera se puede determinar uno de los muchos ciclos en los que interviene el ATP en la levadura: por un lado, el ATP se sintetiza en la mitocondriapor medio de la ATP sintasa, y a nivel de la membrana plasmática, la ATPasa de H+ lo hidroliza para bombear protones al exterior de la célula. El factor común en ambos casos es un flujo de protones a través de la membrana.
Objetivos
1. Que el alumno relacione el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos
por las levaduras.
2. Que el alumno describa las vías por las cuales la glucosagenera los cambios de
pH.
3. Que el alumno interprete el efecto de los inhibidores y los desacoplantes sobre la
salida de protones.
Material
• Vaso de precipitado de 100 ml.
• Pipetas de 5 y 10 ml.
• micropipetas.
• pH-metro.
• Levadura (Saccharomyces cerevisiae) 200 mg/ml.
• Solución de glucosa (10%) para una concentración final de 1%.
• Solución de dinitrofenol 40 mmol/l en etanol.
•Solución de azida de sodio 400 mmol/l.
• Agua destilada.
Método
EXPERIMENTO 1 (control)
1 .Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.
2. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos
de 5 minutos para obtener la línea basal.
3. Adicionar 5 ml de glucosa a 10 %, agitar y medir el pH.
4. Determinar el pH de la solución cada 5 minutos 4 veces,y luego cada 10 minutos 2
veces más.
EXPERIMENTO 2 (DINITROFENOL)
1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.
2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.2 ml de la solución de dinitrofenol 40 mmol/l,
concentración final de 200 μmol/l.
3. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos
de 3 minutos para obtener la línea basal.
4. Esperar 5...