Ciencias

. ACIDO ASCORBICO
8.1. Principio.Separación, identificación y cuantificación delácido ascórbico por cromatografía de líquidos dealta eficacia, detectándolo en el ultravioleta a268nm.8.2. Material y aparatos.8.2.1. Equipo de filtración de muestra y disolven-te para eliminar partículas superiores a 0,5 mm.8.2.2. Cromatógrafo de líquidos equipado condetector de ultravioleta de longitud de ondavariabley registrador.8.2.3. Columna NH
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- Lichorsob de 250 x4,6mm fr 10 mm o similar.8.3. Reactivos.263093 Acetonitrilo-gradiente HPLC131013 Acido L(+)-Ascórbico PA-ACS-ISO131074 Agua PA-ACS131509 Potasio di-Hidrógeno FosfatoPA-ACS-ISO8.3.1. Solución patrón de Acido Ascórbico de300 mg/l, preparada con Acido L(+) - AscórbicoPA-ACS-ISO y Agua PA-ACS y conservada enmatraz color topacio.8.3.2.Solución A: Tampón fosfato pH 3,5. Diso-lución 0,005M de Potasio di-Hidrógeno FosfatoPA-ACS-ISO (KH
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PO
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): Filtrar esta solución con(8.2.1.).8.3.3. Solución B: Acetonitrilo-gradiente HPLC.8.4. Procedimiento.8.4.1. Condiciones cromatográficas orientativas:Fase móvil: Tampón Potasio di-Hidrógeno Fosfa-to/Acetonitrilo-gradiente HPLC: 60/40 (v/v).Flujo : 1 ml/minuto.8.4.2. Calibrado: Inyectar en elcromatógrafoentre 10 y 20 ml de la solución patrón (7.3.1.) y cal-cular el factor de respuesta.CoFactor de respuesta (F) = –––– ApSiendo:Co =Concentración en mg/l de ácido ascór-bico. Ap=Area del pico en el cromatograma de lasolución patrón.8.4.3. Determinación: Homogeneizar. Filtrarmediante (8.2.1.) e inyectar de 10 a 20 ml en el cro-matógrafo.8.5. Cálculos.El contenido de ácido ascórbico, expresadoen
mg/l (sin decimales), se obtendrá mediante lasiguiente fórmula: Acido ascórbico (mg/l) = F x AcSiendo:F =Factor de respuesta. Ac=Area del pico del ácido ascórbico en lamuestra.8.6. Observaciones.8.6.1. La determinación del ácido ascórbico serealizará inmediatamente después de la aperturadel envase.8.6.2. Con este método no se determina ácidodehidroascórbico.

EJEMPLOS PARA PREPARAR LASMUESTRAS:

(a) Determinación del ácido L-arcórbico en el vino.
Ajuste el pH del vino a 3,5-4 con 1 M HCl y diluya con agua o 100 mM de tampón de
fosfato de potasio (pH 3,5) en una concentración idónea de ácido L-ascórbico (véase
tabla de dilución). Decolore el vino tinto con PVPP de la forma siguiente: añada 0,2 g
de PVPP a 10 mL de vino y mezcle durante 5 min. Filtre. El vino que contengaanhídrido sulfuroso (SO2) se trata con formaldehido de la siguiente forma: añada una

gota de solución de formaldehído (aprox. 5 % v/v) a 10 mL de vino, mezcle e incube
durante 5 min a 20-25°C. Ajuste el pH a 3,5-4, diluya si fuera necesario con 100 mM
de tampón de fosfato potásico (pH 3,5) (según la tabla de dilución) y utilice esta
solución para el ensayo. Si se requiere un volumen de muestra de0,2-0,5 mL,
aumente el tiempo de incubación con el ácido ascórbico oxidasa a 5 min.
Normalmente, no se requiere dilución y un volumen de muestra de 0,1-0,5 mL es
adecuado.

(b) Determinación del ácido L-arcórbico en la cerveza.
Después de eliminar el dióxido de carbono removiendo aproximadamente 10 mL de
cerveza con una varilla de vidrio o filtrando, ajuste el pH a 3,5-4 con 1 M HCl (sifuera
necesario). Normalmente, no se requiere dilución y un volumen de muestra de 0,1
mL es adecuado.

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(c) Determinación del ácido L-ascórbico en el zumo de fruta, bebidas y zumos.
La concentración de ácido L-ascórbico de soluciones claras se puede determinar en
general sin tratar la muestra, salvo ajustando el pH a 3,5-4 (si fuera necesario) y
diluyendo según la tabla de dilución.Realice las diluciones con 100 mM de tampón
de fosfato de potasio (pH 3,5) (véase tabla de dilución). Sin embargo, si las
soluciones coloreadas requieren un análisis sin diluir, se pueden decolorar de la
siguiente forma: remueva 10 mL de muestra líquida durante 5 min con 0,2 g de
PVPP y a continuación fíltrelo. Utilice la solución que ha filtrado clara o ligeramente
coloreada en el ensayo....