Clonacion de ADN

INFORME CLONACIÓN DE ADN


UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
BOGOTÁ D.C.
I-2013
1. OBJETIVOS

Realizar el proceso de clonación de ADN in vivo mediante la utilización del vector de clonación pGEM- T.
Confirmar mediante la técnica de PCR la clonación del ADN inserto.

























2. MARCO TEÓRICO
PRINCIPIO DE CLONACIÓN IN VIVO: Básicamente, se tratade insertar el DNA amplificado mediante PCR (inserto) en un plásmido apropiado (DNA vector o vehículo) mediante un proceso denominado ligación, previa linearización (digestión o restricción). Para que esta construcción persista en el tiempo y se amplifique in vivo es necesario introducirla en un hospedador apropiado, como E. coli (células susceptibles para ser competentes) y finalmente poderseleccionar aquellas células portadoras del DNA recombinante utilizado en el proceso. A continuación se comentan estos cuatro pasos de la clonación in vivo:

Restricción: Las enzimas de restricción o restrictasas catalizan el corte de ambas cadena azúcar–fosfato del dsDNA. Parece que estas enzimas no tendrían actividad sobre ssDNA (a menos que éste forme estructuras de doble cadena consigo mismo uotras cadenas sencillas de DNA o RNA).1

Ligación: Las DNA ligasas requieren como sustrato dos extremos de DNA; un extremo 5’ (portador de un grupo fosfato) y un extremo 3’ (grupo hidroxilo de la desoxirribosa). La reacción se produce a partir de sustratos de doble cadena (dsDNA o DNA:RNA), siendo muy poco eficiente con cadenas sencillas aisladas (ssDNA). La ligasa puede unir tanto extremos romoscomo extremos cohesivos (esta última situación es mucho más favorable). También existe la RNA ligasa, capaz de unir extremos de ssRNA y, en menor medida, otras combinaciones de DNA y/o RNA de cadenas sencillas o dobles. 1

Transformación: consiste en el método para introducir material genético en una célula. El método clásico consiste en hacer orificios en las envolturas celulares, lo cualsuele conseguirse mediante diferentes compuestos químicos y tratamientos físicos. Otro sistema más eficiente consiste en la electroporación, que consigue el mismo efecto aplicando una diferencia de potencial relativamente grande en tiempos muy cortos. Una alternativa para células difíciles de transformar por la presencia de una pared celular consistente (vegetales) utiliza sistemas biobalísticos: setrata de bombardear las células o tejidos con partículas microscópicas (generalmente metales pesados como el oro o tungsteno) impregnadas del DNA pasajero. Finalmente, el método más efectivo (usado sólo con células de metazoos) es la microinyección, mediante la cual se inyecta el ADN pasajero con una aguja muy fina y la ayuda de un microscopio a cada una de las células.

Selección: Según elmétodo de transformación utilizado y las células empleadas, pueden aplicarse diferentes métodos de selección de las células que han incorporado el DNA pasajero. Generalmente el vector en que se ha ligado el DNA pasajero suele codificar una o varias enzimas que confieren resistencia a antibióticos, de forma que sólo las células que han incorporado dicho vector (con o sin pasajero) serán capaces decrecer en un medio selectivo suplementado con dicho antibiótico. Para diferenciar entre los transformantes con y sin inserto suele emplearse sustratos cromogénicos.
Algunas estrategias de selección de los transformantes:

Inactivación por inserción
Disrupción de un gen letal
Complementación α

El método Complementación α requiere que el vector usado contenga el sitio de policlonaje dentro dela región codificante del fragmento alfa y la bacteria huésped exprese el otro fragmento de la β-galactosidasa necesario para la complementación. En las bacterias transformadas con el ADN recombinante no existe actividad β-galactosidasa, originando colonias blancas en un medio de cultivo que contiene el sustrato cromógeno X-gal mientras que las colonias no transformadas se verán como colonias...