Comparación de métodos de extracción
Páginas: 5 (1061 palabras)
Publicado: 21 de septiembre de 2015
Comparación de métodos de extracción
La mayoría de los métodos de extracción de ADN de huesos implican la pulverización del hueso, su descalcificación con EDTA y la subsecuente utilización de algún método estándar de extracción de ADN.
Para la descalcificación hay diferentes métodos reportados en la literatura (17, 22, 27-30). este paso puede ser un proceso largo, e implica incubación delpolvo de hueso con muchos cambios de buffer que contienen EDTA 0.5 M, que es un potente secuestrador de calcio.
Hay tres razones básicas para usar la descalcificación como parte del método de extracción: a) el polvo de hueso es muy grande en escala celular para que haya eficiente extracción del ADN. b) la doble hebra de ADN tiene fuerte afinidad por la hidroxiapatita que debe ser removida pararecuperar el ADN inmerso en ella. c) colorantes contaminantes que tienden a precipitar con el ADN y a causar inhibición de la PCR son eliminados con la descalcificación.
Sin embargo, se debe considerar que también existen desventajas en efectuar el proceso de descalcificación como son el mucho tiempo que consume, lo laborioso que resulta y que el EDTA empleado debe ser removido totalmente de laextracción para prevenir la inhibición de la PCR. Por lo que, hay varias publicaciones que reportan que la descalcificación no es necesaria para una extracción exitosa del ADN de huesos (8, 31-34). Fisher et al (8) compararon los métodos con descalcificación y sin descalcificación y encontraron que con la extracción directa de ADN del polvo de hueso, se obtuvo más del doble de ADN, que en el métodoestándar con descalcificación.
Un aspecto que no está completamente aclarado en la comparación de estos métodos es que el ADN obtenido puede diferir cualitativamente. Es posible que, bajo un procedimiento no descalcificante el ADN recuperado de huesos expuestos al medio ambiente venga asociado al de microorganismos, a la vez que se falle en extraer el ADN embebido en la matriz de hidroxiapatita o enosteocitos no expuestos (17).
Otro prometedor método de extracción de ADN de huesos está basado en el lavado del ADN en columnas de hidroxiapatita por incubación en altas concentraciones de fosfato de sodio (34,35). Nielsen et al (34) compararon este método contra los métodos estándar de descalcificación y no descalcificación y recuperaron mucho menos ADN que con los otros métodos. Sin embargo, elADN recuperado de esta forma permitió la amplificación de un ADNmit de 900 pb de longitud, mientras con los otros métodos las amplificaciones no fueron mayores de 150 pb.
Varios otros métodos para la extracción de ADN de huesos sin descalcificar han sido propuestos, incluyendo un procedimiento que implica calentar el polvo de hueso por 2 horas a 95 ° c (19) y el método de Chelex, donde la muestrase hierve en presencia de una matriz quelante (36). Estas extracciones con Chelex no son estables por largos períodos de tiempo, se obtiene sólo ADN de hebra simple y expone el ADN antiguo a potenciales daños por altas temperaturas.
Hoss y Pääbo (37) reportaron la aplicación exitosa de un prometedor método de extracción para ADN antiguo usando sílica, el cual hace uso de la fuerte afinidad delADN a la sílica e incluye la presencia del desnaturalizante isotiocianato de guanidina, que ayuda en la desasociación de las macromoléculas. Esta técnica tiene dos ventajas, primero se elimina rápida y efectivamente los inhibidores de la PCR que fueran aislados simultáneamente con el ADN antiguo y que son el mayor factor limitante en la amplificación del mismo. Segundo, se emplean pocos pasos yreactivos, minimizando así la exposición a contaminación con ADN moderno.
Inhibidores de la PCR
Como se ha mencionado, uno de los aspectos que más confunden y preocupan en la investigación del ADN de huesos son los inhibidores de la PCR que frecuentemente se copurifican con el ADN. Aunque estos inhibidores no han sido específicamente identificados, se les asocia con compuestos químicos de la...
La mayoría de los métodos de extracción de ADN de huesos implican la pulverización del hueso, su descalcificación con EDTA y la subsecuente utilización de algún método estándar de extracción de ADN.
Para la descalcificación hay diferentes métodos reportados en la literatura (17, 22, 27-30). este paso puede ser un proceso largo, e implica incubación delpolvo de hueso con muchos cambios de buffer que contienen EDTA 0.5 M, que es un potente secuestrador de calcio.
Hay tres razones básicas para usar la descalcificación como parte del método de extracción: a) el polvo de hueso es muy grande en escala celular para que haya eficiente extracción del ADN. b) la doble hebra de ADN tiene fuerte afinidad por la hidroxiapatita que debe ser removida pararecuperar el ADN inmerso en ella. c) colorantes contaminantes que tienden a precipitar con el ADN y a causar inhibición de la PCR son eliminados con la descalcificación.
Sin embargo, se debe considerar que también existen desventajas en efectuar el proceso de descalcificación como son el mucho tiempo que consume, lo laborioso que resulta y que el EDTA empleado debe ser removido totalmente de laextracción para prevenir la inhibición de la PCR. Por lo que, hay varias publicaciones que reportan que la descalcificación no es necesaria para una extracción exitosa del ADN de huesos (8, 31-34). Fisher et al (8) compararon los métodos con descalcificación y sin descalcificación y encontraron que con la extracción directa de ADN del polvo de hueso, se obtuvo más del doble de ADN, que en el métodoestándar con descalcificación.
Un aspecto que no está completamente aclarado en la comparación de estos métodos es que el ADN obtenido puede diferir cualitativamente. Es posible que, bajo un procedimiento no descalcificante el ADN recuperado de huesos expuestos al medio ambiente venga asociado al de microorganismos, a la vez que se falle en extraer el ADN embebido en la matriz de hidroxiapatita o enosteocitos no expuestos (17).
Otro prometedor método de extracción de ADN de huesos está basado en el lavado del ADN en columnas de hidroxiapatita por incubación en altas concentraciones de fosfato de sodio (34,35). Nielsen et al (34) compararon este método contra los métodos estándar de descalcificación y no descalcificación y recuperaron mucho menos ADN que con los otros métodos. Sin embargo, elADN recuperado de esta forma permitió la amplificación de un ADNmit de 900 pb de longitud, mientras con los otros métodos las amplificaciones no fueron mayores de 150 pb.
Varios otros métodos para la extracción de ADN de huesos sin descalcificar han sido propuestos, incluyendo un procedimiento que implica calentar el polvo de hueso por 2 horas a 95 ° c (19) y el método de Chelex, donde la muestrase hierve en presencia de una matriz quelante (36). Estas extracciones con Chelex no son estables por largos períodos de tiempo, se obtiene sólo ADN de hebra simple y expone el ADN antiguo a potenciales daños por altas temperaturas.
Hoss y Pääbo (37) reportaron la aplicación exitosa de un prometedor método de extracción para ADN antiguo usando sílica, el cual hace uso de la fuerte afinidad delADN a la sílica e incluye la presencia del desnaturalizante isotiocianato de guanidina, que ayuda en la desasociación de las macromoléculas. Esta técnica tiene dos ventajas, primero se elimina rápida y efectivamente los inhibidores de la PCR que fueran aislados simultáneamente con el ADN antiguo y que son el mayor factor limitante en la amplificación del mismo. Segundo, se emplean pocos pasos yreactivos, minimizando así la exposición a contaminación con ADN moderno.
Inhibidores de la PCR
Como se ha mencionado, uno de los aspectos que más confunden y preocupan en la investigación del ADN de huesos son los inhibidores de la PCR que frecuentemente se copurifican con el ADN. Aunque estos inhibidores no han sido específicamente identificados, se les asocia con compuestos químicos de la...
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