“Concentración separación y Purificación de Proteínas.”

Universidad de Santiago de Chile
Facultad de química y Biología
Departamento de Biología
Bioquímica.











“Concentración separación y Purificación de Proteínas.”







Introducción:
Las diversas características químicas que se estampan sobre estructuras proteicas otorgan a éstas, una amplia gama de métodos para reconocerlas cualitativa y cuantitativamente. Eltamaño de las moléculas, la carga, la reactividad, la afinidad su composición química y su inminente acción tamponante proporcionada por sus propiedades ácido-base que indican que estas puedan ser titulables, hacen de las proteínas las moléculas biológicas más diversas en cuanto a organización y función al interior de los organismos. Es importante además, recordar los estructuras de un polipéptido;siendo la estructura primaria la secuencia covalente de aminoácidos, la estructura secundaria una disposición regular de aminoácidos que se relacionan entre sus vecinos. Por otro lado la estructura terciaria, la cual es una estructura tridimensional completa de una cadena polipeptídica, mientras que estructuras de tipo cuaternario se deben a interacciones entre las subunidades de proteínasmultiméricas o de grandes complejos proteicos. (1)
Para determinar la existencia de proteínas en una solución, se han creado diferentes métodos químicos a partir de la base de las reacciones químicas que puedan ocurrir entre las proteínas y ciertos grupos específicos que son componentes de reactivos (Lowry, Biuret y Bradford); por su parte estos reactivos son capaces de unirse de diversa forma a lasproteínas, abarcando un rango amplio de sensibilidad, siendo el reactivo de Bradford altamente más sensible a bajas concentraciones de proteínas que los otros dos reactivos. Bradford se une a los extremos amino libres de las proteínas por medio del compuesto azul de coomasie. (2)
La separación y purificación de proteínas, se puede realizar por diversas técnicas altamente eficientes; como la cromatografíaen columna (cromatografía de exclusión molecular,cromatografía de afinidad y HPLC)(1) . Las técnicas cromatograficas se basan en el uso de una fase móvil y una fase estacionaria, que indica el tipo de separación que se realiza. La separación por exclusión molecular separa a partir del peso molecular, eluyendo siempre las moléculas de mayor tamaño; mientras, que por otro lado la separaciónutilizando cromatografía de afinidad, relaciona la afinidad que pueda tener las moléculas con la fase estacionaria de la columna y por ello cuando existe una alta afinidad demorará mucho más en eluir el componente que se desea separar. (3)
En su conjunto, la utilización de estas técnicas y el uso de herramientas fisicoquímicas (como la espectrofotometría) otorgan la capacidad de reconocer, separar ypurificar las proteínas.

Objetivos:
Generales:
Determinar concentración de proteínas por el método de Bradford.
Separar proteínas por cromatografía de exclusión molecular.
Específicos:
Elaboración de una curva de calibración.
Determinación de concentración de una muestra problema.
Manejo de cromatografía de exclusión molecular.
Confeccionamiento de un cromatograma.

Materiales ymétodos:
1.1 Determinación de curva de calibración:
Sobre 10 tubos ependorf, se agregó 0, 2, 4, 6, 8, 10, 30, 40 y 50 g de β-galactosidasa a cada uno. Luego se enrasó tubo hasta 50μL con agua destilada; y además se adicionó 450L de reactivo de Bradford en cada tubo. Este procedimiento se realizó por duplicado.
Finalmente se midió la absorbancia de cada solución a 595 nm en un lector de elisa.1.2 Determinación de muestra problema:
Sobre otros dos tubos ependorf, se agregaron 10 L de β-galactosidasa , se enrasó a 50 L con agua destilada y luego se agregó 450 L del reactivo de Bradford; posteriormente se midió la absorbancia para ambas soluciones a 595 nm.

1.3 Separación y purificación de proteínas a través de una cromatografía de exclusión molecular:

En una columna que ya...