Constantes Cinéticas

Laboratorio de Bioconversiones

Práctica No. 2
Determinación de constantes cinéticas, Km y Vmax y medición de la actividad enzimática de enzimas libres.


ÍNDICE

Resumen…………………………………………………………………………………..2
Objetivos…………………………………………………………………………………..2
Introducción………………………………………………………………………………2
Desarrollo experimental………………………………………………………………...5Resultados………………………………………………………………………………...6
Análisis de resultados…………………………………………………………………13
Conclusiones……………………………………………………………………………14
Referencias………………………………………………………………………………14

RESUMEN
Los experimentos de cinética examinan la relación que existe entre la cantidad de producto formado en la unidad de tiempo, de acuerdo a las siguientes condiciones experimentales: pH (7.0), tiempo de reacción y temperatura constante, siendo la única variable la concentración de sustrato. Se trabajó consiete concentraciones de sustrato (almidón) diferentes: 15, 12.5, 10, 5, 2.5, 1.5 y 0.5 g/L respectivamente. En la determinación de constantes cinéticas los resultados se acoplaron mejor al modelo de Lineaweaver-Burk donde a los 3 minutos se obtuvo km= 0.365, Vmax= 0.168 y r2= 0.869; a los 6 minutos, km= 0.446, Vmax= 0.103 y r2= 0.919.

OBJETIVOS
* Calcular las constantes cinéticas, Km yVmax, de una enzima (amilasa).
* Determinar el efecto de la concentración del sustrato en la velocidad de las reacciones enzimáticas.
* Establecer las velocidades iniciales de una reacción enzimática.

INTRODUCCIÓN
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reaccióncatalítica y de la especifidad del enzima, así como las concentraciones de sustrato y formación de productos (Fig. 1). La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc., y se utilizanconcentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

Figura 1. Formación del complejo enzima-sustrato y liberación de productos.
Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicialde sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representa. Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reacción es deorden cero y la velocidad es máxima (Vmax).

La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una hipérbola (Fig. 2). La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y Km corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.

Figura 2. Cinética de tipo Michaelis-Menten.

Paradeterminar gráficamente los valores de Km y Vmax es más sencillo utilizar la representación doble recíproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es una línea recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk (Fig. 3). Es una recta en la cual:
1. La pendiente es Km/Vmax
2. La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/Km
3. La ordenada en el origen(1/[S]0 = 0) es 1/Vmax

Figura 3. Representación de Lineweaver-Burk para determinar las constantes cinéticas.
Importancia de las constantes cinéticas
Km es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. En efecto, si Km = [S], la ecuación de Michaelis-Menten se reduce a: v = Vmax/2....