Cromatografia Liquida

daCROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA
EFICACIA (HPLC)
Determinación de compuestos no volátiles (alto Peso Molecular,
iones metálicos) o termolábiles.


Determinaciones cuantitativas exactas
Aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos,
carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos,
esteroides, etc.
Aplicabilidad a sustancias de interés general(industria, salud,
medioambiente).
Interacciones químicas entre la muestra, la fase móvil y el relleno
de la columna, determina el grado de migración y separación de
componentes contenidos en la muestra.
Solventes como Fase Móvil
•Elución politíptica: se combinan varios tipos de técnicas.
•Elución por gradiente: los distintos analitos son eluídos
con incremento de la composición de la fase móvil enla fase
orgánica.
•Elución Isocrática: composición constante de la fase móvil
La fase móvil puede ser alterada en el transcurso del análisis para
manipular las interacciones de los componentes de la muestra con
la fase estacionaria.
Compuestos con interacciones más fuertes con la fase móvil que
con la fase estacionaria eluirán más rápidamente de la columna
(tiempos de retenciónmenores).

La cromatografía es una de las técnicas más efectivas para separar e identificar los componentes
químicos. El método fue desarrollado por el botánico ruso Mikhail Tswett, en 1906, que utilizó una
columna de carbonato cálcico para la separación de pigmentos vegetales, llegando a la conclusión de
que la clorofila no era un simple compuesto químico. Las técnicas cromatográficas actualestienen
multitud de formas, la mayoría de las cuales pueden ser automatizadas y están adaptadas para el
reparto de gran o pequeña cantidad de sustancias, siendo separadas y purificadas.
.La separación consiste en un proceso de competición donde las moléculas tendrán que elegir en
que fase residen (estacionaria, no se mueve a lo largo del proceso de separación, o móvil, líquida o
gaseosa).. Éstasdiferencias a la hora de elegir son las que aprovechamos para su separación.
El factor de capacidad de un soluto (K) se define como el cociente del tiempo que el soluto
permanece en la fase estacionaria y el que permanece en la fase móvil. En condiciones isocráticas
equivale a la relación de moléculas que en un instante de tiempo se encuentran en fase móvil y en fase
estacionaria.
Es una medidade la retención de los compuestos, siendo función de;
. La composición del relleno de la columna
. La polaridad de la fase móvil
Concentración en fase A
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− = Kd
Concentración en fase B
Un cromatograma es la respuesta captada por un detector en función del tiempo de elución o
volumen. Consiste en una serie de picos que representan la elución de los analitosindividuales. El
tiempo de retención tR para cada analito tiene dos componentes. El primero es el tiempo que tarda la
molécula de analito en pasar a través de los espacios libres entre la matriz de la fase estacionaria. Este
aspecto se refiere al volumen de la columna vacía, V0, y el tiempo que tarde en pasar a través de ella,
tM. El valor de tM debe ser el mismo para todos a los analitos y puede sermedido usando un soluto que
no interaccione con la fase estacionaria y que simplemente gaste su tiempo de elución en que la fase
móvil recorra todo el volumen vacío. El segundo componente es el tiempo en el que el analito es
retenido por la fase estacionaria, t´R. Este tiempo es característico de cada analito.
Su valor que es el tiempo de retención viene dado por:
t´R = tR - tM
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El factor decapacidad, K´ es el parámetro más importante en cromatografía. Es simplemente
el tiempo adicional que el analito tarde en eluir de la columna respecto a un analito no
retenido que no interacciona con la fase estacionaria y que por definición tiene un valor de K´
igual a 0:
tR - tM t´R
K´ = −−−−−−− = −−−−−−−
tM tM
K´ se relaciona con el coeficiente de distribución del analito que era...