cromatografia y electroforesis de amionácidos en papel

Química Biológica

1° Trabajo Práctico de Laboratorio

Cromatografía y Electroforesis de Aminoácidos en Papel







Objetivos:
Comprender los fundamentos teóricos de las técnicas utilizadas.
Analizar los resultados obtenidos desde el fundamento teórico y la composición del sistema en estudio.
Fundamentos teóricos:
Cromatografía: Es un método físico de separación en el cual loscomponentes a separar se distribuyen entre dos fases, una que es estacionaria y otra móvil que se mueve en una dirección determinada, es un método que se basa en la afinidad diferencial de los componentes a separar entre una fase móvil versus una fase estacionaria.
La fase móvil es un líquido o un gas que fluye de manera ininterrumpida a través de una fase estacionaria, que consiste en partículasempaquetadas en algún tipo de soporte que puede ser papel, columna, placa de vidrio, etc.
Cuando la muestra formada por varios solutos se introduce con la fase móvil y se permite su migración a través de la fase estacionaria, se producirá la separación debido a que algunos son atraídos con mayor intensidad por alguna de las dos fases.
Las moléculas que tengan poca afinidad por la faseestacionaria, pasarán más tiempo en contacto con la fase móvil, se moverán con mayor velocidad y serán removidas de la columna en primer término.
Existen distintos tipos de cromatografía:
Cromatografía de intercambio iónico:
La separación de basa en la afinidad de un soluto por una fase estacionaria cargada electroestáticamente.
La fase estacionaria consiste en una resina sintética provista degrupos funcionales con carga iónica neta.
La fase móvil puede ser un buffer.
Los solutos pueden tener carga positiva, negativa o neutra. Aquellos que tengan una carga opuesta a la resina se unirán por atracción electroestática fuerte, pero de manera reversible a la fase estacionaria (pueden liberarse por modificación del pH o fuerza iónica). La fuerza de esta unión dependerá del signo y la magnitudde la carga del soluto. Cuanto mayor sea la densidad de carga mayor será la interacción. Los de igual carga que la resina son más afines a la fase móvil por lo que son los primeros en eluir.
Este tipo de cromatografía se subdivide a su vez en:
Cromatografía de intercambio catiónico: retiene cationes cargados positivamente debido a que la fase estacionaria muestra un grupo funcional cargadonegativamente, como un ácido fosfórico.
Cromatografía de intercambio de aniones: retiene aniones usando grupos funcionales cargados positivamente, como un catión de amonio cuaternario.

Cromatografía de filtración en gel: Permite separa moléculas por su peso molecular, tamaño y forma.
La fase estacionaria consiste en una resina porosa de un tamaño controlado y la fase móvil en un buffer.
Lasmoléculas de gran tamaño, no pueden penetrar directamente los poros, por lo tanto son excluidos y viajan en el frente de la fase móvil. Las moléculas de menor tamaño tienen la capacidad de movilizarse a través del interior de los poros, interaccionan más tiempo con la fase estacionaria. Cuanto mayor sea el tamaño de la molécula se moverá con mayor velocidad.
Cromatografía sobre papel: Cromatografíaplana. La celulosa en un soporte y a medida que se produce la corrida cromatográfica los solutos se distribuyen entre la fase estacionaria inmovilizada (agua) y la fase móvil (solvente de desarrollo).
Aquellas sustancias cuya polaridad les permita ser mas afines con la fase estacionaria, interactuan mas tiempo con esta y por lo tanto se veran retrasadas respecto de aquellas que son mas afines conla fase movil.
Cuando los compuestos no son coloreados se debe recurrir a tecnicas de deteccion que puede ser por fluorencia o reactivos que le impartan color como la ninhidrina en el caso de aminoacidos.
La posicion de la sustancia puede ser descrita a travez del coeficionte de retardo (Rf) que se define como el cociente entre la distancia recorrida por el un soluto y la distancia alcanzada...