Cromatografia

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En la presente práctica se aplico la cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) para determinar la vitamina c. Esta técnica separa los componentes de la muestra utilizada (jugo de limón) (fase estacionaria) inyectada en la columna después de haber sido centrifugada y finamente filtrada mediante el paso de una combinación de disolventes (agua 35%, metanol 65%) (Fase móvil) que se mezclacon la muestra y arrastran a sus componentes impulsados por la bomba separándolos dentro de la columna en función a la interacción entre las dos fases determinando la vitamina c mediante la comparación del tiempo de arrastre mostrado en un cromatograma que se obtuvo mediante el detector al pasar por el cromatografo soluciones puras de vitamina c.

1. Conocer las partes de un equipocromatografía liquida de alta resolución (HPLC) y sus funciones.
2. Determinar el contenido de azucares simples por HPLC.

CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA PERFORMANCIA
I. FUNDAMENTO TEÓRICO
DODSON, K. Y. & YOUNG, E. R. & SOLIMAN, A. El método del reconocimiento de la vitamina c por cromatografía de alta performancia consiste en la extracción del ácido ascórbico (AA) y el dehidroascórbico (DHAA)con reactivos y condiciones que eviten al máximo su deterioro. Esto se logra utilizando una disolución extractora de ácido metafosfórico y EDTA que protege al ácido ascórbico de la oxidación por el aire y la luz. El extracto es analizado por cromatografía líquida de alta resolución donde los dos compuestos se separan y cuantifican simultáneamente. El ácido ascórbico se detecta y cuantifica porespectrofotometría ultravioleta mientras que el dehidroascórbico se cuantifica por la formación de un derivado poscolumna que se detecta por fluorescencia. La cuantificación e identificación de los ácidos se realiza inyectando patrones de concentración conocida, los cuales se utilizan para calibrar el equipo en cuanto a concentraciones y para la identificación de los tiempos de retención.

Losparámetros analizados para la validación de este método fueron los siguientes:

• Linealidad
• Ámbito (10-200 mg/L)
• Veracidad (% recuperación)
• Precisión (RSDr %)
• Límite de detección
• Límite de cuantificación

VILVANOA GISBERT EUGENIO, (2004) Las primeras columnas de LC tenían una longitud de varias decenas de cm, un diámetro interno de 10 a 50 mm y las fases estacionariasutilizadas tenían un tamaño de partícula de entre 100 y 200 um. Las fases móviles se hacían fluir atraves de las columnas por gravedad o utilizando bombas peristálticas que conseguían unos flujos de hasta 0.3 – 0.5 ml/min. Los intentos de acelerar los flujos aplicando mayor predetector.

En primer lugar se observan unos recipientes (botellas) que contienen los disolventes que constituirán la fasemóvil. Las botellas suelen estar tapadas con un tapón agujereado y atravesado por los tubos de teflón. Por uno se puede hacer pasar He para desgasificar la disolución. El otro está conectado a la bomba y por el circula la fase móvil a la salida de la botella y antes de llegar a la bomba se puede instalar un dispositivo de seguridad para eliminar pequeñas burbujas que, si se introdujeran en elsistema producirían incrementos de presión y disminución del flujo de fase móvil.
Dado que el sistema opera a alta presión los gases disueltos en la fase móvil tienden a escapar de ella causando microburbujas que dan lugar a cambios significativos de presión y flujo, si se producen en la columna y a picos agudos en forma de espiga, si se producen en el detector. El problema es especialmente graveen lo que toca al oxigeno presente en las disoluciones acuosas. Para evitarlo se puede sonicar la fase móvil durante aproximadamente 5 minutos y también burbujear He en el recipiente durante el tiempo de funcionamiento del HPLC.
La bomba es el sistema encargado de impulsar la fase móvil. Absorbe el disolvente de la botella por una tubería de teflón de varios mm de diámetro y lo desplaza...
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