Cromatografia

Bioquímica

Tema 5. Cromatografía.

CONCEPTO

• Es un conjunto de métodos analíticos de separación mediante su diferente distribución entre dos fases: una Fase Fija y otra Fase Móvil Identificación y cuantificación.
• Definición: Técnica que permite separar los componentes de una muestra debido a su diferente afinidad entre dos fases inmiscibles entre si, una estacionaria (líquida osólida) y otra móvil (gas
o líquida).
• Definición: Técnica de separación de mezclas de sustancias, basada en la distinta distribución y, por tanto, distinta velocidad de estos componentes a través de un medio poroso o líquido, fase
fija, al ser arrastrados por un disolvente en movimiento, fase móvil (cuya cualidad principal debe ser que pueda solubilizar al analito).
• Ventajas: Rapidez,simplicidad, bajo coste, buen método de separación, posibilidad de análisis cuantitativo de las sustancias ya separadas.

ANALÍTOS

• Separa sustancias orgánicas complejas: aminoácidos, proteínas, vitaminas, hidratos de carbono, lípidos, nucleótidos, subpoblaciones celulares, etc.

PRINCIPIO FÍSICO

1. Diferente DISTRIBUCIÓN de los componentes de una mezcla, entre una fase fija y otra móvil.
̵ Fasemóvil o Eluyente: es un disolvente Líquido o Gaseoso + muestra.
̵ Fase fija o Estacionaria: es un producto que ejerce una retención, en grado distinto, sobre analitos a separar. En él se deposita la muestra.
2. Los componentes de la muestra son vehiculizados – arrastrados por el eluyente o fase móvil a lo largo de la fase estacionaria que retiene más unos que otros cuando interactúa con ellos.Analito con > afinidad por fase estacionaria se retrasará / Analito con < afinidad por fase estacionaria se adelantará.
3. La diferencia de movilidad o separación en:
̵ Bandas (cromatografía plana).
̵ Elución en distintos tiempos (cromatografía en columna). Estas bandas y elusiones pueden ser analizadas cualitativamente y cuantitativamente.
• Poder de resolución: capacidad para separar losdiversos componentes de la muestra sometida a estudio.

Según naturaleza de las fases
• Cromatografía de líquidos: fase móvil es un líquido.
̵ Tipo Líquido-sólido: PLANA – ADSORCIÓN, COLUMNA – INTERCAMBIO IÓNICO/EXCLUSION/AFINIDAD
̵ Tipo Líquido-líquido: PLANA - DE REPARTO

CLASIFICACIÓN
DE LAS TÉCNICAS

• Cromatografía de gases: fase móvil es un gas.
̵ Tipo Gas-sólido: COLUMNA –ADSORCION/INTERCAMBIO IÓNICO/EXCLUSIÓN/AFINIDAD
̵ Tipo Gas-líquido: COLUMNA – DE REPARTO

Según la forma en que está dispuesta la fase fija
• Cromatografía plana: la fase fija en un soporte plano y la móvil se desplaza por capilaridad o por gravedad. Las sustancias quedan separadas en una serie de bandas.
̵ Tipo en papel. El papel actúa como soporte de la fase fija en el caso de que sea de tipolíquido-líquido.
̵ Tipo en capa fina.
• Cromatografía en columna: la fase fija está en un soporte en forma de tubo (de fino calibre). La muestra, disuelta en la fase móvil, se coloca en el superior de la columna y se hace pasar por ella
por presión o por gravedad, por lo que se van separando en distintos tiempos al ser retenidas en distinta intensidad. La de gases siempre se realiza en columna.M.A.N.S.

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Bioquímica

Tema 5. Cromatografía.

Según el mecanismo de actuación de la fase fija
• Según el tipo de interacción entre las sustancias a separar y la fase estacionaria.
• Cromatografía de adsorción:
̵ Interacción: Interaccionan los analitos con un adsorbente, usado como fase fija, que es un sólido con varios grupos activos capaces de atraer a los analitos y retenerlos en susuperficie. Los más usados son: gel de sílice y sefarosa.
̵ Desarrollo: El sólido adsorbente interacciona con distinta intensidad con los analitos, es decir, los retiene con distinto grado (debido a que los grupos funcionales son
distintos). Los compuestos con mayor afinidad para el adsorbente serán más retenidos y se desplazarán poco respecto al punto de aplicación de la muestra.
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