Cuantificación proteínas
Yolanda Aguilera García yagugar@upo.es Tutoría: Jueves de 15 a 16h y de 19 a 20h Despacho: Edificio 22, 3ª planta
EVALUACIÓN DE PRÁCTICAS
La nota de prácticas supone un 36% de la nota final que se repartirá: • • • • 15% Asistencia 15% Informe de prácticas 35% Examen de practicas semanal que será teórico 35% Examen final dedestreza que será práctico
PRÁCTICA 1: RECONOCIMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
OBJETIVOS: •Observar el efecto de diversos agentes sobre una solución proteica •Conocer las diferentes reacciones colorimétricas para identificar proteínas •Conocer los diferentes métodos de cuantificación de proteínas.
COAGULACIÓN DE PROTEÍNAS
AGENTES DESNATURALIZANTES: •TEMPERATURA •COMPUESTOS POLARES•pH •SALES
DESNATURALIZACION: Solubilidad y fuerza iónica
DESNATURALIZACION
PROTOCOLO: TUBO MUESTRA: 4 tubos de ensayo con 1ml de MUESTRA 1
TUBO 1
1ml de Acetona/ Metanol
TUBO 2
1ml de HCl/ NaOH 40%
TUBO 3
1ml de ClNa 20%
TUBO 4
Temperatura 100º
RESULTADOS:
TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 Agente Agente Agente Agente
REACCIÓN DE BIURET
OBJETIVO: Es un método que detecta lapresencia de compuestos con dos o más enlaces peptídicos y, por tanto, sirve para todas las proteínas y péptidos cortos.
H N H2N C O C NH2 O
-
O
H C NH
O
H HN C
O NH O
HN C NH
-
Cu++ O
HN C H
O
H
Biuret Complejo cúprico coloreado
REACCIÓN DE BIURET
PROTOCOLO: 1. TUBO MUESTRA:
TUBO 1
4 tubos de ensayo con 1ml de MUESTRA
TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4
1mlMuestra 1 + 1 ml Reactivo de Biuret + 1ml NaOH 20%
1ml Muestra 2 + 1 ml Reactivo de Biuret + 1ml NaOH 20%
1ml Muestra 3 + 1 ml Reactivo de Biuret + 1ml NaOH 20%
1ml Muestra 4 + 1 ml Reactivo de Biuret + 1ml NaOH 20%
MEZCLAR Y OBSERVAR RESULTADOS
REACCIÓN DE BIURET
RESULTADOS:
TUBO 1 : BIURET ( + ) , TUBO 2 : BIURET ( ± ) , TUBO 3 : BIURET ( + ) , TUBO 4 : BIURET ( --) ,
SI SISI NO
HAY PROTEÍNAS HAY PROTEÍNAS HAY PROTEÍNAS HAY PROTEÍNAS
REACCIÓN DE NINHIDRINA
OBJETIVO: Es un método que nos permite detectar y cuantificar aminoácidos libres.
O CH3 OH O + NH3 OH OH O OH H O + NH3 + CO2 +
CH3 OH H
O
NINHIDRINA
ALANINA
O HO HO OH + NH3 + H O HIDRIDANTINA
O N O
NINHIDRINA
COMPUESTO COLOREADO
-O
O + 3 H2O
O
O
REACCIÓN DENINHIDRINA
PROTOCOLO: 1. TUBO MUESTRA:
TUBO 1
4 tubos de ensayo con 1ml de MUESTRA
TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4
1ml Muestra 1 + 0.5 ml de reactivo de ninhidrina
1ml Muestra 2 + 0.5 ml de reactivo de ninhidrina
1ml Muestra 3 + 0.5 ml de reactivo de ninhidrina
1ml Muestra 4 + 0.5 ml de reactivo de ninhidrina
MEZCLAR E INCUBAR 1 MINUTO A 100ºC
REACCIÓN DE NINHIDRINA
RESULTADOS:Ninhidrina (-)
Ninhidrina (+)
TUBO 1 : NINHIDRINA ( - ) , TUBO 2 : NINHIDRINA ( - ) , TUBO 3 : NINHIDRINA ( - ) , TUBO 4 : NINHIDRINA (+ ) ,
NO NO NO SI
HAY AMINOÁCIDOS LIBRES HAY AMINOÁCIDOS LIBRES HAY AMINOÁCIDOS LIBRES HAY AMINOÁCIDOS LIBRES
CONCLUSIONES FINALES
MUESTRA 1 : BIURET (+) y NINHIDRINA (-) MUESTRA 2 : BIURET (+) y NINHIDRINA (-) MUESTRA 3 : BIURET (+) y NINHIDRINA (-)MUESTRA 4 : BIURET (-) y NINHIDRINA (+)
TIENE PROTEÍNAS TIENE PROTEÍNAS TIENE PROTEÍNAS NO TIENE PROTEÍNAS, TIENE AMINOÁCIDIOS
REACCIÓN XANTOPROTEICA
OBJETIVO: Es un método que nos permite detectar aminoácidos con grupos fenilo (tirosina, triptofano y fenilalanina)
COOH C NH+3 CH2
H2O
R NO2 NO2
+ 2 HNO3
R NO2
+
NO2 AMARILLO
NaOH
R NO2Na NO2Na
+ CO2
ANARANJADOREACCIÓN XANTOPROTEICA
PROTOCOLO: 1. TUBO MUESTRA:
TUBO 1
4 tubos de ensayo con 1ml de MUESTRA
TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4
1ml Muestra 1 + 1 ml de HNO3 concentrado
1ml Muestra 2 + 1 ml de HNO3 concentrado
1ml Muestra 3 + 1 ml de HNO3 concentrado
1ml Muestra 4 + 1 ml de HNO3 concentrado
MEZCLAR E INCUBAR 5 MINUTOS A 100ºC
Colocar en hielo y agregar 3ml de NaOH 40%
REACCIÓN...
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