cuantificacion de microorganismos

PRÁCTICA # 1

“CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR TURBIDIMETRÍA”

OBJETIVO:

Explicar el fundamento de las técnicas más utilizadas en el recuento microbiano.
Establecer la cantidad de microorganismos en na muestra mediante la aplicación de diferentes métodos.
Relacionar los resultados obtenidos y explicar las causas que determinan la variación de estos.

INTRODUCCIÓN

Paratrabajar con un microorganismo en condiciones definidas en el laboratorio es necesario primero proceder a su aislamiento, es decir a separarlo del resto de las poblaciones con las que coexiste en la naturaleza.

Para el aislamiento se de organismos utilizan medios sólidos (agar. Ventajas) o líquidos.

· Medios sólidos: siembra (extensión o vertido) en placa. Separación e inmovilización de organismosde forma individualizada en un medio nutritivo sólido. Cada individuo al multiplicarse origina una colonia. Método: diluciones consecutivas de la muestra.
· Medios líquidos: Solo utilizable para aislar la especie predominante en un cultivo mixto. Método de la dilución límite.
· Medios selectivos: Medios que favorecen el crecimiento de un microorganismo específico. Se emplean cuando el organismoque quiere aislarse se encuentra en forma minoritaria. Pueden utilizarse para:
Enriquecer: medios líquidos que tienden a seleccionar los organismos de tasa de crecimiento más elevada entre todos aquellos que pueden hacerlo bajo las condiciones impuestas
Aislar directamente: medios sólidos que permiten aislar colonias. Suelen llevar un inhibidor que impide el desarrollo de los demásmicroorganismos.

Los métodos de aislamiento microscópicos tienen poca (o nula) utilidad en Microbiología.

El crecimiento de una población o cultivo bacterianos se puede expresar en función de:

Aumento del número de células
aumento de masa del cultivo

Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que estén en crecimiento balanceado o equilibrado (en el que todos loscomponentes aumentan una misma proporción por unidad de tiempo).

Cuantificación de microorganismos:

Recuento de viables: Se utiliza una técnica similar al aislamiento en placa: diluciones seriadas y siembra en placas (30-300 bacterias/placa).
Recuento de totales.
Medida del número de células:
- Directo mediante microscopio (cámaras de recuento de Newbaver).
- Contador electrónico de partículas(contador de Coulter)
Medida de la masa celular.
Turbidimetría (densidad óptica). Se utiliza un colorímetro (Repasar la ley de Lamber- Beer: A= bC, o log Ii/It = k*C). Es el método más utilizado.
Peso seco

Medida de la masa celular

Métodos Directos: En estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas.

1) Determinación del peso húmedo: se tara un tubode centrífuga; se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante; se determina el peso del sedimento.
- Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.
2) Determinación del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105ºC,toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso húmedo.
- Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.
3) Determinación del nitrógeno total: técnica demicro-Kjeldahl.
4) Determinación de un componente característico: peptidoglucano, ADN, ARN, proteínas, ATP, clorofilas en organismos fotosintéticos, etc.

Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros métodos más fáciles dan errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes naturales.

Métodos...