Cuantificacionproteinas biuret y lowry

DETERMINACIÓN DE PROTEINAS POR EL MÉTODO DE BIURET Y FOLIN-LOWRY

PROFESORAS: Luz Yurany Moreno – Adis Ayala Fajardo

OBJETIVOS

1. Cuantificar la concentración de proteínas presentes en muestras biológicas como suero, líquido cefalorraquídeo (LCR), tejido animal, tejido vegetal, entre otros, por el mètodo de Biuret y Lowry.
2. Establecer los valores de referencia de concentración deproteínas en LCR, suero y fríjol.
3. Utilizar diferentes métodos de cuantificación de proteínas teniendo en cuenta la concentración de las mismas presentes en la muestra.
4. Establecer las características clínicas al obtener valores incrementados o disminuidos de proteínas en LCR y suero, respecto a los valores de referencia.
5. Construir una línea de calibración a partir de patronesde albúmina Sérica Bovina que permita establecer la cantidad de proteína en muestras problemas.

ASPECTO TEÓRICO DEL MÉTODO DE BIURET

Cuando la úrea es calentada a cerca de 180 °C se descompone para dar un producto llamado “BIURET” el cual en presencia de cobre, en solución alcalina forma un complejo de color violeta (figura 1).

[pic]

Figura 1. Reacción del reactivo de Biuret con lasproteínas

El color en la reacción es dado por:

a. Sustancia que contiene dos grupos unidos directamente a través de C ó N.

b. Estructuras peptídicas que contienen al menos dos enlaces peptídicos.

Esta reacción es la base de la determinación de proteínas en suero y otros fluidos biológicos.

La máxima absorbancia del complejo proteína – Biuret en la región del visible se obtiene a545 nm cuando la absorbancia se lee contra un blanco de reactivos de Biuret. Si la curva se lee contra blanco de H2O, el máximo de absorbancia se obtiene a 580 nm. El complejo proteína – Biuret también presenta un máximo a 300 nm, donde se incrementa cuatro veces la sensibilidad y la interferencia por turbidez.

Curvas de absorción del complejo proteína – Biuret.
a. Blanco de reactivoscontra H2O
b. Complejo proteína – Biuret contra agua
c. Complejo proteína – Biuret contra blanco de reactivos

Reactivos:

1. Reactivo de Biuret: (Reactivo para determinación cualitativa de Glucosa).
a. Disuelva 17.3 g de CuSO4 . 5 H2O en aproximadamente 100 ml de H2O.
b. Disuelva 173 g de Citrato de Sodio y 100 g de Na2CO3 anhidro en aproximadamente 800 ml de H2O calentadosimultáneamente. Cuando se enfríe coloque la solución a en la b mientras agita y diluya a 1 L. Estable 1 año a temperatura ambiente.
2. NaOH 3 %
3. Estándares de Proteínas:
a. Pool de sueros claros que contenga de 6 – 8 g de proteína por el Método de Kjeldhal, corregido para NPN.
b. Estándar estabilizado y estable de proteína que puede conseguirse comercialmente. Por ejemplo albúmina séricabovina.
Preparar estándares de 10, 5, 2.5 g/ dL de albúmina.

Procedimiento:

| |Blanco |2,5 g/dL |5,0 g/dL |10 g/dL |Suero |MP |
|NaCl 0,9% | |75 µl |50 µl | | | |
|Estándar 10g/dl ||25 µl | | | | |
|Estándar 10g/dl | | |50 µl | | | |
|Estándar 10g/dl | | | |100 µl | | |
|Suero || | | |100 µl | |
|MP | | | | | |100 µl |
|NaOH 3% |5 ml |4,9ml |4,9ml |4,9ml |4,9ml |4,9ml |
|Biuret |1 ml...