Cuantificación ácidos fenólicos

3.- Diseñe un protocolo de cuantificación de los metabolitos secundarios separados.

PREPURIFICACIÓN DE LA MUESTRA – Ácidos fenólicos

Someter a una extracción líquido-líquido el extracto crudode ácidos fenólicos, utilizando cloroformo/agua .Esto permitirá limpiar la muestra se sustancias como grasas, cloroplastos etc.

FRACCIONAMIENTO POR COLUMNA PREPARATIVA

1.-Obtenido elextracto prepurificado, fraccionar mediante la técnica de cromatografía en columna preparativa, esto con el fin de separar suficiente cantidad de muestra para su respectivo análisis.

2.- Escoger unacolumna adecuada. Dada la muestra de compuestos fenólicos se recomienda utilizar una columna preparativa de poliamida, cuyo fundamento es la separación por tamaño, las partículas mas pequeñas como ácidosfenólicos y flavonoides eluirán primero y las más grandes como antocianos o taninos lo harán último, a partir de esto se obtendrán distintos tipos de fracciones con distintos compuestos cada unosegún el tiempo en que se demoren en eluir).

3.- Escoger el solvente adecuado. Es necesario que el solvente no interactúe con la fase estacionaria y pueda eluir lo mas eficientemente los compuestos afraccionar sin solubilizarse. Para el caso de los compuestos fenólicos se recomiendo utilizar como solvente metanol-agua

Una vez obtenida las distintas fracciones de ácidos fenólios, flavonoides,antocianos y taninos identificadas de acuerdo a su tiempo de elución, cuantificar por medio HPLC.

CUANTIFICACIÓN POR HPLC ( mediante el método del patrón interno )

1.-Curva de calibración :Preparar soluciones patrones de distintas concentraciones de cada uno de los metabolitos a cuantificar , en caso de no haber utilizar otra sustancia compatible con la cuantificación de dicho metabolito.Cada solución debe contener la misma cantidad de patrón interno.
2.- Inyectar las distintas soluciones y obtener su respectivo cromatogramas.
3.- Calcular el cuociente ÁreaAnalito/ÁreaPatrón...