Cuestionario TP 1

 
Grupo 1: Juan Valentin Coronel, Natalia Diotti, Martin Leytur, Juan Pablo 

Tp1 
 
Extracción de ADN Cromosómico de E. Coli 
 
Intro 1 Dentro de las células procariotas encontramos a las bacterias y dentro de estas se 
encuentran un tipo que se tiñen de azul oscuro por medio de la tinción de Gram (bacterias 
Gram positivas) y otras que con esta tinción no, en cambio adquieren un color rosado tenue. Esta propiedad química está relacionada con la estructura de la envoltura celular del tipo de 
bacteria. En las Gram positivas, la envoltura celular comprende la membrana citoplasmática y una pared celular más externa compuesta por una capa de peptidoglicano. Ésta última 
confiere a las bacterias gran resistencia y es la que retiene el tinte en la tinción, a diferencia de las Gram negativas que poseen un segunda membrana lipídica externa y entre 
membranas hay una pared muy fina como para retener color.  
 
Intro 2 Se trabajó con un buffer de 2ml de bacterias cosechadas por centrifugación, provenientes 
de un cultivo de 50 ml de Escherichia Coli y se extrajo el ADN cromosómico de estas 
rompiendo su membrana y su pared celular. Nuestro buffer de tris­HCL contaba con PH normal 8 y sacarosa 25 % p/v y se trabajó siempre en hielo para mantener la actividad 
enzimática de las bacterias lo más baja posible. 
 
Se le agregó a la solución con bacterias por medio de una micropipeta P1000: 0,8 ml de EDTA (Ácido Etilen Diamino Tetraácetico) 0.25 M PH=8. La función de esto es secuestrar 
los Iones de Mg inactivando las nucleasas que degradan ADN ya que es es un cofactor de estas, también secuestra iones Ca causando inestabilidad en la membrana. 
Se agitó con una varilla suavemente 10 minutos y posteriormente se le agregó con una micropipeta P1000 0.4 ml de lisozima (10 mg/ml), para romper la pared peptidoglicano de la 
bacteria, se revolvió y se dejó reposar 10 minutos. 
Ahora se continuó trabajando a temperatura ambiente, ya que las nucleasas ya estaban ...