Daño Oxidativo

Cuantificación de metionina y metionina sulfoxido



Objetivo:

Determinar y cuantificar metionina y metionina sulfoxido presente en las proteínas de plasma sanguíneo.


Introducción:

La metionina es uno de los aminoácidos más susceptibles a experimentar reacciones de oxidación, las que pueden ser ocasionadas por una gran variedad de agentes oxidantes, tales como: H2O2, radicalhidroxilo, HOCl, cloraminas, peroxinitrito, entre otros. El producto de oxidación de la metionina, la metionina sulfoxido, puede ser reducido nuevamente a metionina, mediante la enzima metionina sulfoxido reductasa. Esta enzima constituye uno de los pocos mecanismos conocidos, por los que se puede reparar aminoácidos oxidados en proteínas.
La oxidación de metionina ha sido asociada con numerosaspatologías relacionadas con el envejecimiento, puesto que un gran número de proteínas pierden su funcionalidad por la oxidación de residuos de metionina.


Principio:

El principio de la detección se basa en la hidrólisis acida de la proteína y la posterior derivatización de la metionina (y otros aminoácidos) con OPA, el cual produce un fluoroforo que es detectado por su fluorescencia a los455nm.



Figura 1. Esquema de reacción entre: o-phenaldehyde (OPA), la estructura básica de aminoácidos y β-mercaptoetanol.






Aplicación:

Determinación del daño oxidativo en péptidos y proteinas

Reactivos:

- Metanol grado HPLC J. T. Backer # 9093-03
- Acetato de Sodio (CH3COONa) Merck # 1.06268.1000, M: 82.03 g/mol
-Tetrahidrofurano(THF) Merck # 1.09731.1000, M:72.11g/mol
- Acido Metanosulfónico (MSA)
- Acido Bórico (H3BO4) Merck # 1.00165.1000, M: 61.83 g/mol
- Fenol
- o- Phthaldialdehyde Merck # 8.21027.0010, M: 134.14 g/mol


Preparación de Soluciones:

MSA 3N:
Se toman 19.4mL de MSA y se transfieren a un matraz aforado de 100mL, se pesan 0.2g de fenol en un pesa sales, se agregan al matraz. La solución es agitada hasta la completa disolución delsólido, finalmente se completa a 100mL con H2O 3X.

Buffer Borato de Potasio 0.7M:
Se pesan 4.33g de H3BO3 y se disuelven en aproximadamente 70mL de H2O 3X, la solución se lleva a pH 10.4 con KOH 2N y se completa a 100mL de volumen final.

OPA2-Me (esta solución se prepara por el día)
- 80L de solución Stock de OPA 0.2M en metanol
- 160L de solución al 2% de 2-Me en borato de potasio
-800L de buffer borato de potasio 0.7 M
OPA 0.2M stock:
Se pesan 27mg de OPA y se disuelven en 1mL de metanol. Esta solución se guarda a -70ºC por 3 meses.
Se debe tener precaución forrar la solución stock con papel aluminio y guardar a -70 ºC apenas se haya tomado el volumen necesario para preparar la solución de OPA-2Me.
En caso de observar problemas en la reproducibilidad de las medidas hacerlas soluciones con un nuevo stock de OPA 0.2M.

2-Me al 2% en borato de potasio:
Se mezclan 10 L de 2-mercaptoetanol con 490 L de buffer borato de potasio 0.7 M. Esta solución se prepara por el día.

Buffer acetato de sodio 75 mM pH 4.5 (Fases móviles A y B, HPLC):
Se pesan 2.25g de acetato de sodio anhidro (CH3COONa) y se disuelven en aprox. 250mL de H2O 3X, se adicionan 2.72 mL de ácidoacético glacial y se completa a 1L con H2O 3X.
Materiales:
- Columna ODS3 5m, 4.6 x 150 mm (Genesys, Chile, Item Nº 186311)
- Balanza analítica
- Micropipeta de 200-1000 L
- Micropipeta de 40-200 L
- Micropipeta de 5-40 L
- pH metro
- Filtros de Nylon 66, Chrom Tech. (Se adquiere en Genesys Chile).
- Microjeringa de 50L


Metodología:

Tratamientos previos a realizarse alas muestras.

Muestras de plasma.
En un eppendorf de 1.5mL, se agrega 10L de plasma (obtenido en citrato) y se adicionan gota a gota 45L de acetonitrilo, agitando con un vortex el tubo, esto permite precipitar las proteínas presentes en el plasma, posteriormente se centrifuga a 10000 rpm por 5 minutos. El sobrenadante obtenido se descarta, se lava el precipitado con 45L de acetonitrilo,...