Desarrollo De Habilidades Del Pensamiento

Ensayos de transferencia de tinte
Para el ensayo de microinyección, B16 células fueron infectadas o no con Salmonella y después de 24 horas, fueron microinyectadas 400 células bajo un microscopio de contraste de fase invertida (Axiovert 100, Zeiss) con una mezcla de 2% amarillo de Lucifer CH (457.25 Dalton, Sigma) y 1% tetramethylrhodamine dextrano (70 kDSondas moleculares) con un sistemaautomatizado de microinyección a una presión de 1200 hPa solicitado 0,2 s.
Para el ensayo de la FACS, DCs fueron etiquetados con 10 mM DDAO (sondas moleculares) durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y, a continuación, ampliamente lavados con PBS. B16 células fueron infectadas o no con Salmonella y, después de 24 horas, etiquetadas con 0,5 mM calceína-AM (sondas moleculares) en mediolibre de suero durante 30 minutos a 37 ° C y, a continuación, cocultured con controladores de dominio en una proporción de 2: 1. Transferencia de calceína entre las células del tumor y DCs fue evaluada por cytofluorimetry. El coculture de B16 o controladores de dominio se llevó a cabo en la presencia o ausencia de 3,5 mM heptanol (Sigma).
Para ensayo confocal, B16 células fueron infectadas o nocon Salmonella y 24 horas más tarde, teñidas con 3 mM calceína-AM en medio libre de suero durante 20 minutos a 37 ° C, mientras que DCs, previamente tratados con LPS durante 1 hora, fueron teñidos con 1 mM DDAO durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la Mancha, una gota de cada población fue revestida de cerca uno de otro en microscopio y células fueron coincubated por 1 hora.Transferencia de color se visualiza por una Leica SP2 Visible láser microscopio Confocal. La película se generó con el software de Imaris.
Ensayo in vitro de Cruz-presentación
Células B16 y B16 óvulos fueron tratadas o no con Salmonella y 24 horas más tarde, manchadas de 5 mM CFSE durante 20 minutos a 37 ° C en la oscuridad y luego lavar con PBS frío. Cuando declaró, células B16 y B16 óvulos fuerontratadas con lactacystin de 10 mM (Sigma) durante la noche. Las células tumorales luego agregaron a DCs previamente madurados con LPS (1 mg/ml) y IFN-g (100 U/ml) en una relación de 1: 1 y la izquierda en coculture durante 24 horas en la presencia o ausencia de heptanol (3,5 mM). Después de 24 horas, crosspresentation de péptidos de óvulos por DCs fue analizado por cytofluorimetry en CD11c +células con un anticuerpo que reconoce el péptido óvulos SIINFEKL en asociación con MHC me (anti-KbOVA, 25-D1.16).

Análisis de IFN-g en el tumor masa
B16 control y Cx43shRNAB16-rodamiento ratones fueron inyectado con Salmonella o PBS como un control intratumoral, y después de 1, 3 y 7 días, los tumores fueron eliminados y rompieron en 1 ml de PBS que contengan 0,5% Tritón X-100, incubados en hielodurante 1 hora y centrifuga a 13.000 rpm a 4 ° C por 15 minutos sobrenadantes analizaron la presencia de IFN-g por ensayo ELISA enzima vinculada (ELISA) (R & D Systems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis de IFN-g producen in vitro por linfocitos t CD8 óvulos específicos
B16 óvulos control (Ctrl-B16-óvulos) y Cx43-interfirió B16-óvulos (Cx43shRNAB16-óvulos) fueroninfectados con Salmonella y cocultured con DCs previamente madurados con LPS (1 mg/ml) y IFN-g (100 U/ml) en una proporción de 1: 1. Después de 24 horas, fueron CD11c + DCs purificado (Mac) y tratados con la mitomicina C (25 mg/ml) por 20 minutos a 37 ° C para detener la proliferación de las células tumorales restantes. DC (2 × 104) fueron cultivadas con 2 × 105 CD 8 células t purificadas de ratones OTIcon y sin péptido de 1 mM OVA(257–264). Después de 48 horas, se evaluó la cultura sobrenadante para IFN-g por ELISA.
Análisis estadístico
Prueba de pares t de Student se utilizó para determinar el significado estadístico de los datos. Importancia se definió como p < 0,05 (prueba de dos colas y parámetros de dos muestras igual variación). Se realizaron cálculos estadísticos y curvas de...