“Determinación de la actividad de enzimas proteolíticas” método de kunitz

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

MÉTODOS ANÁLITICOS II

“Determinación de la Actividad de Enzimas Proteolíticas”
Método de Kunitz





Objetivos
* Determianr la actividad proteolítica de enzimas como la bromelaína, papaína, entre otras.
* Elaborar una curva la cual refleje la actividad enzimática de dichas enzimas.
* El objetivodel presente trabajo fue evaluar la obtención de bromelaína a partir de cáscara, corazón y pulpa de la piña así como determinar la actividad enzimática y específica. Así como de papaína presente en el ablandador de carne.

Resultados
Tabla 1. Actividad Enzimática de la Tripsina
Tubo | Concentración de Tripsina (mg/mL) | A280 | A280 corregida |
| | Problema | Testigo | |
T1 y 1 | 0.04| 0.241 | 0.085 | 0.156 |
T2 y 2 | 0.08 | 0.35 | 0.084 | 0.266 |
T3 y 3 | 0.12 | 0.463 | 0.084 | 0.379 |
T4 y 4 | 0.16 | 0.512 | 0.086 | 0.426 |
T5 y 5 | 0.2 | 0.619 | 0.086 | 0.533 |
Problemas |
TI y I | Bromelaína 1:10 | 0.866 | 0.231 | 0.635 |
TII y II | Bromelaína 1:20 | 0.591 | 0.166 | 0.425 |
TIII y III | Papaína | 0.502 | 0.137 | 0.365 |

Grafico 1. Curva de ActividadEnzimática de Tripsina (mg/mL) a una absorbancia corregida de 280 nm.
Unidad Tríptica: “La cantidad de enzima que se origina bajo condiciones experimentales descritas, un aumento de una unidad de absorbancia a 280 nm, por un minuto de digestión”
m= | 2.3325 |
(UT)mgcas = | pendiente de la recta /20 |
(UT)mgcas = | 2.332/20= 0.1166 |
Calculo:

Hay 0.1166 Unidades Trípticas por cadamiligramo de Tripsina.
Tabla 2.Curva de la actividad enzimática específica para la digestión de caseína por tripsina.
UT | A280 corregida |
0.00466 | 0.156 |
0.00938 | 0.266 |
0.0134 | 0.365 |
0.0186 | 0.445 |
0.0233 | 0.533 |

Grafico 2. Actividad enzimática especifica de la Tripsina en función de las unidades Trípticas por mg de la enzima en cuestión en un minuto de digestión.

Indiquela actividad específica, en unidades trípticas por gramo de muestra de la piña (bromelaína) y el ablandador (papaína). .0778
Utilizando la ecuación de la recta despejamos X y sustituimos: X=y-b/m
Bromelaína 1:10 A 280= 0.635, X=0.635-0.0755/20= 0.027x10(dilución)/25(g de piña) =0.011UT
Bromelaína 1:20 A 280= 0.425, X=0.425-0.0755/20= 0.017x20(dilución)/25(g de piña) =0.013UT
PapaínaA 280= 0.365, X=0.365-0.0755/20= 0.014x1000/120(g de ablandador) /1000=0.00016UT

Preguntas adicionales

a) Defina actividad enzimática y actividad enzimática específica

Actividad específica: La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/mL). Es el número de unidades de enzima por mg de proteína.Actividad enzimática: Relación entre la actividad enzimática y la cantidad de proteína. Proporciona información sobre las velocidades de reacción, miden también la afinidad de las enzimas por los sustratos y los inhibidores, y proporcionan conocimientos sobre los mecanismos de reacción.
b) Escriba la clasificación de las proteasa, en función de su mecanismo de acción y diga en que grupo seubican las determinadas en la práctica.

Se clasifican por su modo de acción catalítica (endo- o exo-actividad) o con base en su sitio catalítico. Las endoproteasas hidrolizan enlaces amídicos dentro de la cadena de la proteína. Las exoproteasas, por el contrario, eliminan aminoácidos terminales de las proteínas o péptidos. La naturaleza del centro catalítico de las proteasas difiere de acuerdo conlos aminoácidos y otros ligandos que intervienen en la formación del complejo enzima-sustrato.
El centro activo contiene aminoácidos o bien cationes metálicos que promueven la catálisis, denominándose serinproteasas, cisteinproteasas, aspartato proteasas, según intervengan los aminoácidos serina, cisteína o ácido aspártico. En las metalo-proteasas la
actividad está promovida por un catión...