determinacion de la actividad de enzimas proteoliticas
Páginas: 7 (1525 palabras)
Publicado: 10 de febrero de 2014
Practica no.5
Determinación de la actividad de enzimas proteolíticas.
Método de Kunitz
INTRODUCCION:
El estudio de las enzimas es de primordial importancia para las ciencias biológicas, ya que la vida misma depende de un sinnúmero de reacciones químicas que se llevan a cabo en el organismo gracias a la intervención de las enzimas.
Las peptidasas (antes conocidas como proteasas)son enzimas que rompen los enlaces peptídicos de las proteínas por la hidrólisis de un grupo amida.
Dentro de las peptidasas encontramos; Bromelaína, Papaína, Tripsina, etc.
Estas enzimas hidrolizan proteínas por lisis (ruptura) de enlaces peptídicos, con la introducción de una molécula de agua. La tripsina es una enzima secretada por el páncreas en la mayoría de los animales.
La Bromelaínaes una enzima que se encuentra en las piñas o ananás que descomponen proteínas como el colágeno y la fibra muscular.
La papaína es una enzima extraída de la papaya y que esta presente en los ablandadores de carne, ya que también es una enzima proteolítica.
Un método utilizado para la determinación de la actividad de las enzimas proteolíticas es el método de Kunitz, que se basa en medir lacantidad de péptidos y aminoácidos solubles liberados durante la hidrólisis aprovechando la capacidad de algunos de ellos de absorber selectivamente a 280 nm.
RESULTADOS experimentales:
A
280
Tubo
[ ] Tripsina
Problema
Testigo
A280 corregida
T1 y 1
0.04
0.291
0.046
0.245
T2 y 2
0.08
0.389
0.042
0.347
T3 y 3
0.12
0.442
0.052
0.39
T4y 4
0.16
0.46
0.051
0.409
T5 y 5
0.2
0.581
0.034
0.547
PROBLEMAS
TI y I
Bromelaína 1:10
0.655
0.117
0.538
TII y II
Bromelaina 1:20
0.332
0.168
0.164
TIII y III
Papaína
0.309
0.089
0.220
¿Cuántas unidades trípticas hay por miligramo de tripsina?. Incluya los cálculos
Sabemos que UT =
UT=
2.3357
= 0.11675 mg de tripcina
20
Curva deactividad enzimática específica.
UT tubo1 =
UT tubo2 =
UT tubo3 =
UT tubo4 =
UT tubo51 =
Tubo
UT
A280 corregida
1
0.00467
0.245
2
0.00934
0.347
3
0.01401
0.39
4
0.01868
0.409
5
0.02335
0.547
Actividad Específica por gramo de muestra de:
Bromelaína
Para la dilución 1:10 sustituimos de la ecuación y = 14.261x + 0.1878 a y que es igual a laabsorbancia A280 de Bromelaína a 1:10 y sustituimos X
0.538 = 14.261x + 0.1878
UT=
0.538 - 0.1878
= 0.0245
14.261
0.1764 UT/g
Para la dilución 1:20 sustituimos de la ecuación y = 14.261x + 0.1878 a y que es igual a la absorbancia A280 de Bromelaína a 1:20 y sustituimos X
UT=
0.168 - 0.1878
= 0.00138
14.261
0.1987 UT/g
Papaína
Sustituimos de la ecuación y =14.261x + 0.1878 a y que es igual a la absorbancia A280 de Papaína y sustituimos X
UT=
0.220 - 0.1878
= 0.00225
14.261
0.00375UT /mg = 3.75 UT/ g
Preguntas adicionales.
a) Defina actividad enzimática y actividad enzimática específica
Actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza 1.0 micromol de substrato por minuto a 25°C en las condiciones demedida óptimas.
Actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína. Es una medida de la pureza de la enzima, aumenta durante la purificación de una enzima y llega a ser máxima y se mantiene constante cuando está en estado puro.
b) Escriba la clasificación de la proteasas, en función de su mecanismo de acción y diga en qué grupo se ubican las determinadas en lapráctica.
Peptidasas serínicas y treonínicas. El mecanismo catalítico depende del hidroxilo de un residuo de serina que actúa como nucleófilo sobre el enlace peptídico. Pertenecen a este grupo las familias de la tripsina y de la subtilisina.
Peptidasas cisteínicas. La enzima y el sustrato forman un complejo covalente debido a que el nucleófilo es parte de un aminoácido. El dador de protones en...
Determinación de la actividad de enzimas proteolíticas.
Método de Kunitz
INTRODUCCION:
El estudio de las enzimas es de primordial importancia para las ciencias biológicas, ya que la vida misma depende de un sinnúmero de reacciones químicas que se llevan a cabo en el organismo gracias a la intervención de las enzimas.
Las peptidasas (antes conocidas como proteasas)son enzimas que rompen los enlaces peptídicos de las proteínas por la hidrólisis de un grupo amida.
Dentro de las peptidasas encontramos; Bromelaína, Papaína, Tripsina, etc.
Estas enzimas hidrolizan proteínas por lisis (ruptura) de enlaces peptídicos, con la introducción de una molécula de agua. La tripsina es una enzima secretada por el páncreas en la mayoría de los animales.
La Bromelaínaes una enzima que se encuentra en las piñas o ananás que descomponen proteínas como el colágeno y la fibra muscular.
La papaína es una enzima extraída de la papaya y que esta presente en los ablandadores de carne, ya que también es una enzima proteolítica.
Un método utilizado para la determinación de la actividad de las enzimas proteolíticas es el método de Kunitz, que se basa en medir lacantidad de péptidos y aminoácidos solubles liberados durante la hidrólisis aprovechando la capacidad de algunos de ellos de absorber selectivamente a 280 nm.
RESULTADOS experimentales:
A
280
Tubo
[ ] Tripsina
Problema
Testigo
A280 corregida
T1 y 1
0.04
0.291
0.046
0.245
T2 y 2
0.08
0.389
0.042
0.347
T3 y 3
0.12
0.442
0.052
0.39
T4y 4
0.16
0.46
0.051
0.409
T5 y 5
0.2
0.581
0.034
0.547
PROBLEMAS
TI y I
Bromelaína 1:10
0.655
0.117
0.538
TII y II
Bromelaina 1:20
0.332
0.168
0.164
TIII y III
Papaína
0.309
0.089
0.220
¿Cuántas unidades trípticas hay por miligramo de tripsina?. Incluya los cálculos
Sabemos que UT =
UT=
2.3357
= 0.11675 mg de tripcina
20
Curva deactividad enzimática específica.
UT tubo1 =
UT tubo2 =
UT tubo3 =
UT tubo4 =
UT tubo51 =
Tubo
UT
A280 corregida
1
0.00467
0.245
2
0.00934
0.347
3
0.01401
0.39
4
0.01868
0.409
5
0.02335
0.547
Actividad Específica por gramo de muestra de:
Bromelaína
Para la dilución 1:10 sustituimos de la ecuación y = 14.261x + 0.1878 a y que es igual a laabsorbancia A280 de Bromelaína a 1:10 y sustituimos X
0.538 = 14.261x + 0.1878
UT=
0.538 - 0.1878
= 0.0245
14.261
0.1764 UT/g
Para la dilución 1:20 sustituimos de la ecuación y = 14.261x + 0.1878 a y que es igual a la absorbancia A280 de Bromelaína a 1:20 y sustituimos X
UT=
0.168 - 0.1878
= 0.00138
14.261
0.1987 UT/g
Papaína
Sustituimos de la ecuación y =14.261x + 0.1878 a y que es igual a la absorbancia A280 de Papaína y sustituimos X
UT=
0.220 - 0.1878
= 0.00225
14.261
0.00375UT /mg = 3.75 UT/ g
Preguntas adicionales.
a) Defina actividad enzimática y actividad enzimática específica
Actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza 1.0 micromol de substrato por minuto a 25°C en las condiciones demedida óptimas.
Actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína. Es una medida de la pureza de la enzima, aumenta durante la purificación de una enzima y llega a ser máxima y se mantiene constante cuando está en estado puro.
b) Escriba la clasificación de la proteasas, en función de su mecanismo de acción y diga en qué grupo se ubican las determinadas en lapráctica.
Peptidasas serínicas y treonínicas. El mecanismo catalítico depende del hidroxilo de un residuo de serina que actúa como nucleófilo sobre el enlace peptídico. Pertenecen a este grupo las familias de la tripsina y de la subtilisina.
Peptidasas cisteínicas. La enzima y el sustrato forman un complejo covalente debido a que el nucleófilo es parte de un aminoácido. El dador de protones en...
Leer documento completo
Regístrate para leer el documento completo.