Determinación Del Peso Molecular De Una Proteína Usando Cromatografía Por Exclusión Molecular

“Determinación del peso molecular de una proteína usando cromatografía por exclusión molecular. "

Objetivos:

* Utilizar el gel apropiado para eluir proteínas de peso molecular conocido y determinar su volumen de elución.
* Determinar el peso molecular de una proteína problema por interpolación de su volumen de elución.
* Mencionar las ventajas y limitaciones del método.Introducción:
La cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada filtración en gel) es una de las técnicas más sencillas de las empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos.
Este tipo de cromatografía se realiza en columnas cilíndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fin (dextranos, agarosa o poliacrilamida).
En esta cromatografía, la fase estacionariaconsiste en largos polímeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa.
Las columnas se empaquetan con pequeñas partículas esferoidales formadas por esos polímeros entrecruzados.
En consecuencia, estas partículas son porosas, y el tamaño de los poros es tal que algunas moléculas (las demasiado grandes) no podrán ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientementepequeñas) podrán pasar a través de ellos.
Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las moléculas que acceden al interior de esta.
* Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de una columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el diámetro de los poros de laspartículas, sólo podrán moverse en su camino, a través de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partículas; y por lo tanto, no se verán retrasadas en su descenso.
En cambio aquellas moléculas capaces de penetrar en las partículas se verán retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamaño. Por lo tanto, las moléculas eluyen en este tipo de cromatografía pororden decreciente de tamaño molecular.
* Las mallas del gel permiten la entrada selectiva de las partículas de menor masa molecular.
De ahí que las partículas de mayor peso molecular salgan primero.
Intervalo de fraccionamiento de un determinado tipo de gel, como los valores extremos (Máximo y mínimo) de pesos moleculares entre los cuales el gel tiene capacidad de separar.
Volumen de elución, esel volumen necesario para eluir un compuesto de una columna.

Datos experimentales:

1. Determinación del volumen de vacio (V0) de la columna.

No. De fracción | Volumen de elución (mL) | A615 |
1 | 3 | 0 |
2 | 6 | 0 |
3 | 9 | 0 |
4 | 12 | 0 |
5 | 15 | 0 |
6 | 18 | 0 |
7 | 21 | 0.454 |
8 | 24 | 0.647 |
9 | 27 | 0.138 |
10 | 30 | 0.034 |
11 | 33 | 0.004 |
12 | 36 | 0 |
13 | 39 |0 |
14 | 42 | 0 |
15 | 45 | 0 |
V0

a) Construir el perfil de elución de la dextrana azul 2000, para determinar el volumen vacio de la columna.

.

2. Determinación del volumen de elución (Ve), de las proteínas patrón y problema.

Vol. De elución | Absorbancia |
| Proteína 1A. bovina | Proteína 2Lisozima | Proteína 3hemoglobina | Proteína 4O. Albumina | Proteína problema |
3 | 0 | 0 |0 | 0 | 0 |
6 | 0.015 | 0 | 0 | 0 | 0.004 |
9 | 0.007 | 0 | 0 | 0 | 0.036 |
12 | 0.004 | 0 | 0 | 0 | 0 |
15 | 0.039 | 0 | 0.007 | 0 | 0 |
18 | 0.053 | 0 | 0.086 | 0.542 | 0.044 |
21 | 0.388 | 0 | 2.073 | 0.019 | 0.301 |
24 | 0.41 | 0 | 2.495 | 0 | 0.496 |
27 | 0.199 | 0 | 1.992 | 0 | 0.596 |
30 | 0.104 | 0 | 1.26 | 0 | 0.479 |
33 | 0.06 | 0.9 | 0.731 | 0 | 0.304 |
36 | 0.056 | 0.439 |0.393 | 0 | 0.214 |
39 | 0.023 | 0.877 | 0.198 | 0 | 0.237 |
42 | 0.007 | 1.107 | 0.105 | 0 | 0.258 |
45 | 0.013 | 1.057 | 0.053 | 0 | 0.158 |
48 | 0.026 | 0.799 | 0.016 | 0 | 0.053 |
51 | 0.011 | 0.518 | 0.013 | 0 | 0 |
54 | 0 | 0.279 | 0.007 | 0 | 0 |
57 | 0 | 0.144 | 0 | 0 | 0 |
60 | 0 | 0.076 | 0 | 0 | 0 |
63 | 0 | 0.044 | 0 | 0 | 0 |
66 | 0 | 0.027 | 0 | 0 | 0 |
69 | 0 | 0.014...