Determinacion Cuantitativa De Prote Nas 2013


DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEINAS

Objetivos:
Al finalizar este trabajo práctico los alumnos estarán en capacidad de:
Conocer el principio que rige la espectrofotometría.
Interpretar el basamento químico de la Ley de Beer-Lambert.
Conocer el principio que rige la determinación cuantitativa de proteínas por los métodos de Biuret y Bradford.
Calcular la concentración de proteínas enmuestras biológicas.
Introducción:
Conceptos básicos sobre espectrofotometría
La espectrofotometría es uno de los métodos analíticos de mayor importancia y utilidad en bioquímica ya que permite medir la cantidad relativa de luz absorbida o transmitida por la materia (ej. moléculas biológicas en disolución acuosa: proteínas, aminoácidos, metabolitos, etc.) medida como absorbancia (Abs) o transmitancia(%T), respectivamente.
La absorbancia es la medida de la cantidad de luz bloqueada o absorbida por una solución. Las moléculas que absorben luz se llaman cromóforos. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos, aquellas longitudes de onda no absorbida. Todas las sustancias puedenabsorber energía radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente, absorbe longitudes de ondas que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.
La absorción de las radiaciones visibles, ultravioleta e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química.
La transmitancia es el parámetroinverso de la absorbancia, constituye la medida porcentual de la cantidad de radiación o luz que pasa a través de la solución. De este modo, una solución no coloreada no absorbente, mostrará 100% de transmitancia en un espectrofotómetro calibrado, y 0,00 de absorbancia (Figura 1).

Figura 1. Relación entre absorbancia y transmitancia.
Para medir la absorbancia y/o transmitancia de un compuestoen solución se utiliza el espectrofotómetro, instrumento que permite determinar la radiación absorbida o transmitida por una solución, a una determinada longitud de onda.
Los componentes básicos de cualquier espectrofotómetro son: 1.-Fuente de luz o radiación la cuál tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda que abarca (usualmente es una lámpara de tungsteno para luz visible, yuna de deuterio para luz ultravioleta); 2. Monocromador que selecciona la longitud de onda deseada del espectro y la dispersa al compartimiento de la muestra; 3.-Compartimiento para la muestra y 4.-Fotodetector, que mide cuantitativamente la radiación que pasa por la muestra (Figura 2).









Figura 2. Componentes de un espectrofotómetro

Los avances tecnológicos de los últimos años hanpermitido mejorar la precisión y versatilidad de los espectrofotómetros, por lo tanto hay diversos modelos disponibles en el mercado, según la utilidad que se le va a dar.

Ley de Beer- Lambert.
La fracción de luz incidente que es absorbida por una solución depende de la longitud de onda, de la concentración del compuesto absorbente en solución y de su naturaleza química. La relación matemática entreestas variables fue establecida por Beer- Lambert y se expresa con la siguiente ecuación:
A = εcl
Donde:
A = Absorbancia o densidad óptica, ε = Coeficiente de absortividad molar (constante), c = Concentración de la muestra y l = Longitud de onda
Si se mantiene constante l, tenemos que A es directamente proporcional a la concentración de la muestra.
De este modo, la ley de Beer- Lambertestablece que la concentración de un analito en solución, es directamente proporcional a la cantidad de energía radiante absorbida e inversamente proporcional al logaritmo de la energía radiante transmitida.
Cuando se desconoce la concentración de un analito, ésta puede ser determinada a partir de una curva de calibración que se construye graficando los valores de absorbancia contra distintas...