Determinacion

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD
OBJETIVOS:
* Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico
* Determinar el efecto de algunas sustancias no proteicas, que pueden interferir en el método
* Determinar si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y exactitud con el método de Lowry
*Analizar las ventajas y desventajas de éste método, con respecto a otros métodos para la determinación cuantitativa de proteínas
INTRODUCCIÓN:
El método de Bradford se basa en que el Azul Brillante de Coomasie G-250 existe en dos diferentes colores: rojo y azul. El rojo es convertido a la forma azul a partir de la unión del colorante con la proteína, éste complejo se lee a 595nm. Éste método es muyreproducible y rápido en el proceso de unión de la proteína con el colorante y tiene buena estabilidad.
DATOS EXPERIMENTALES E INFORME:
Tabla 1. Curva de calibración de hemoglobina por el método de Bradford
Tubo no. | Cantidad de proteína (μg) | A595nm | Datos ajustados |
| | Serie A | Serie B | |
1 | 25 | 0.251 | 0.183 | 0.277 |
2 | 50 | 0.372 | 0.442 | 0.365 |
3 | 75 | 0.474 |0.524 | 0.452 |
4 | 100 | 0.605 | 0.534 | 0.539 |
5 | 125 | 0.611 | 0.539 | 0.627 |

1. La ecuación de la recta es y = a + bx ; con el método de mínimos cuadrados se obtuvieron los siguientes valores para la curva de calibración:
Pendiente (b) =3.5*10-3 Ordenada al origen (a) = 0.1899 Coeficiente de correlación (r) = 0.906

Y para la curva ajustada se tiene:
Pendiente (b) =3.49*10-3Ordenada al origen (a) = 0.1898

1. La curva cumple con la ley de Bouger y Beer en el intervalo de 25 a 125μg de proteína.

2. A partir de la ecuación de la recta ajustada por regresión lineal se obtuvo una expresión matemática para calcular la cantidad de proteína:
x= y-0.18980.00349

Tabla 2. Réplicas para el análisis estadístico
Tubo no. | A595nm | Cantidad de proteína (μg) |1 | 0.542 | 100.9 |
2 | 0.594 | 115.8 |
3 | 0.516 | 93.5 |
4 | 0.603 | 118.4 |
5 | 0.615 | 121.8 |
6 | 0.566 | 107.8 |
7 | 0.523 | 95.5 |
8 | 0.578 | 111.2 |
9 | 0.558 | 105.5 |
10 | 0.565 | 107.5 |
Tabla 3. Resultados del análisis estadístico
X | S | S2 | %CV | μ |
107.8 | 9.38 | 87.9 | 8.7 | 6.71 |
Para calcular t-Student y F-Fisher se calculan las diferencias de cadapunto:
Bradford | Lowry | Para obtener tcalc:
tcalc= D nSD tcalc= 9.97 107.986 = 3.947 ttablas=2.262
Como tcalc≥ttablas , entonces existe una diferencia significativa en exactitud entre ambos métodos.
Para obtener Fcalc:
Fcalc=S2So2 Fcalc=87.9266.092 = 1.768 Ftablas=4.03
Como Fcalc≤Ftablas, entonces no existe diferencia significativa en la precisión entreambos métodos.

D |
100.9 | 97.3 | 3.6 |
115.8 | 88.6 | 27 |
93.5 | 83.2 | 10 |
118.4 | 103.6 | 15 |
121.8 | 113.2 | 8.6 |
107.8 | 100.9 | 6.9 |
95.5 | 97.3 | -1.8 |
111.2 | 95.9 | 15 |
105.5 | 101.4 | 4.1 |
107.5 | 96.8 | 11 |
Tabla 4. Efecto de algunas sustancias no proteícas en el método de Bradford
Tubo no. | Sustancia | A595nm | Cantidad de proteína (μg) | Tipo deinterferencia |
1 | Tris 1M pH | 0.545 | 101.5 | - |
2 | Glicerol al 1% (v/v) | 0.580 | 111.5 | + |
3 | Detergente comercial al 1% | 0.431 | 68.9 | - |
4 | SDS al 1% | 0.400 | 60 | - |
5 | Mercaptoetanol al 0.1% | 0.664 | 135.5 | + |
Referencia | Tubo 3 de la curva tipo | 0.452 | 75 | |
1 | TCA al 5% | 517 | 78.02 | + |
2 | Fenol al 1% | 483 | 69.30 | + |
3 | Urea al 5% | 390 |45.46 | No |
4 | (NH4)2SO4 al 3% | 441 | 58.53 | No |
5 | Tris 1M pH 10 | 345 | 84.69 | + |
Referencia | Tubo 3 de la curva tipo | | | |

Éste método presenta interferencias con los buffers alcalinos (Tris pH 10), tambien se puedo comprobar que no existen interferencias con el sulfato de amonio. En la bibliografía mencionan que el SDS al 1% provoca un aumento considerable al leer la...