DNA genomico

PRACTICA Nº2 : AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE DNA GENÓMICO


1.- OBJETIVO
Aislar los ácidos nucleicos( fundamentalmente DNA) por la lisis celular a partir de tejido de animal, elhígado de rata.
Calcular la concentración de los ácidos nucleicos y la pureza del DNA realizando su absorbancia en el espectrofotómetro.


2.- FUNDAMENTO

Para poder aislar el DNA cromosómicoes necesario recurrir a procedimientos químicos y mecánicos, como la lisis celular.
El DNA contiene un elevado peso molecular por ello es necesario la utilización de SDS, detergente, que rompe lasbicapas lipídicas, tanto la nuclear como la plasmática e inactiva a las nucleasas. Sera preciso purificar la muestra para eliminar el alto contenido de proteínas como los restos lipídicos, utilizando elSEVAG que desnaturalizara las proteínas y harán que precipiten, esta precipitación estará formada por ácidos nucleicos de la disolución y sales. Tras su lavado y eliminación de posibles restos desales se podrá realizar el análisis del aislamiento del DNA cromosómico.


3.- MATERIAL
Homogenizador
micropipetas: 100-10000 micro-litros
20-200 micro-litros
2-20 micro-litros
mortero
pinzas
6eppendorfs
puntas desechables de micropipeta
gradilla de eppendorfs
cubetas
espectrofotómetro
centrifugadora para eppendors
material de lavado(fairy, agua, agua destilada...)


4.- REACTIVOSagua destilada
tampón homogeinización (Tris-HCl 50mM ph:7,6/EDTA 100mM)
TE (tris-HCl 10 mM/EDTA, pH=7,6)
acetato sódico 3M
reactivo SEVAG (cloroformo:isoamilalcohol(24:1))
etanol al 70% y al90%(-20°C)
SDS( detergente)
agua destilada
T.E.


5.- MUESTRA
1 gramo de hígado de rata.


6.- TÉCNICA

1. Homogeneizar el gramo de hígado junto con los 3ml del tampón de homogenización conun mortero.
2. Enfriar 10 minutos en hielo.
3. Coger 300μl de lo homogeneizado y depositarlos con un eppendorf. Se añade 20 μl del SDS, detergente que rompe la bicapa lipidica( membrana nuclear y...