doble híbrido de levadura

Sistema del doble híbrido en levaduras.

Saccharomyces cerevisiae, y médios para los ensayos y controles del DH



En el saber popular la genómica es algo cuasi-divino, en las películas, la tele incluso entre muchos científicos, se pensaba que la secuenciación del genoma sería una panacea a todas nuestras dudas. Pero la realidad fue bien distinta, el genoma secuenciado ayudó muchísimo alos científicos y ha tenido multitud de consecuencias directas sobre nuestra vida, pero me atrevería a decir que son más las preguntas que nos ha generado que las respuesta que nos ha dado.

Tras tener en la mano una inmensa lista de letras desordenadas, se empezó a pensar en nuevas ciencias, las llamada "-omicas" una de ellas, la proteómica.

Inicialmente la forma de ver "qué" hacía la proteínaera mutarla mediante mutagénesis dirigida o sobre-expresión. Con ello unas veces la célula interrumpía su ciclo, moría o cualquier otra cosa... Pero eran muchas las proteínas que no hacían "nada"

Para estos casos se empezaron a usar distintas técnicas para ver con quién interactuaban estas proteínas. Algunas de estas técnicas:

-Cromatografía por afinidad:

Consiste en sobre-expresar unaproteina y después pasarla por un extracto celular para ver con qué interacciona. Tiene bastantes problemas, para empezar asumimos una enorme cantidad de proteína que no existen en condiciones normales. Además al lisar la célula la proteína quizás termine interactuando con proteínas a las cuales no tendría acceso in vivo.

-Co-inmuno precipitación (CO-IP):

Esta técnica es in vivo al contrarioque la anterior. Asumiendo que las interaccones dentro de la célula no se crean "de novo". Se aplica un anticuerpo contra la proteína que estemos estudiando, hacemos un lisado celular y posteriormente "pescamos" el anticuerpo esperando que con él vengan la proteína a estudiar y alguna más pegada a ella. El problema de este método es la poca cantidad de material que obtenemos.

Sistema del doblehíbrido en levaduras.

Método del que hablaremos con más profundidad en esta entrada. Es un método que aunque artificial, por usar proteínas bacterianas sobre levaduras (eucariotas), es in vivo. Se basa en el uso de factores de transcripción. Estos factores de transcripción suelen tener dos dominios, el activation domain (AD) o dominio de activación de la transcripción, y el binding domain (BD)o dominio de unión al ADN. De estos dos, el verdaderamente específico es el BD, el cual se une a genes promotores de los mensajeros.


Para comenzar separaremos AD de BD, después construiremos el primer híbrido será BD del activador GAL4 y la proteína X . El segundo híbrido será el dominio AD de GAL4 y la proteína Y.

BD y AD separados no son capaces de mostrar transcripción, necesitan estarunidos. Esta característica es la que usaremos para el ensayo si la proteina X e Y se reconocen se unirán y se volverá a producir transcripción, confirmando que ambas proteinas están relacionadas.

El siguiente paso consistirá en codificar plásmidos que posean estos complejos, BD-X y AD-Y. Además en cada plásmido se incluirá información para codificar un aminoácido. Triptófano y leucina ennuestro caso.


Usaremos una cepa modificada de Saccharomyces cerevisiae axótrofa para Triptófano, Leucina e histidina. Además debe carecer de promotores factores para Gal. Esta cepa incluye en su genoma dos construcciones indicadoras. El gen de levadura his3 y el bacterianoLacZ. Bajo el control de un promotor dependiente de GAL4





Después de ayudar a las levaduras a incorporar los dosplásmidos, cultivaremos para seleccionarlas en un medio sin leucina ni triptófano. Y las que crezcan estarán listas para las distintas pruebas.

Si no has entendido demasiado no te preocupes, vamos a hacer un pequeño resumen de lo dicho. Nuestra levadura es incapaz de producir por si misma aminoácidos fundamentales como son la histidina, triptófano y leucina. Para que se desarrolle debemos incluir...