Electroforesis 2d

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Características de la Electroforesis bidimensional

La electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2D PAGE) es la herramienta más empleada para el análisis global y la separación delos componentes del proteoma. Dicha técnica permite la separación de cientos o miles de proteínas (“spots”) en un único gel, mostrando un patrón característico.

La Separación de Proteínas mediante2D PAGE pasa por las siguientes etapas:

Preparación de la muestra :Es el paso más crítico y clave en el éxito del experimento. En él se emplean agentes caotrópicos, surfactantes y agentesreductores. Los agentes caotrópicos como la urea y tiourea, provocan la desnaturalización de las proteínas por ruptura de puentes de hidrógeno, dejando expuestos los residuos hidrofóbicos que son solubilizadospor los agentes surfactantes. Los agentes reductores como el DTT (aunque también se emplean otros reductores alternativos no cargados), completan la desnaturalización proteica por ruptura de puentesdisulfuro.

Separación en la 1ª Dimensión (Isoelectroenfoque): En primer lugar las proteínas se separan en base a su punto isoeléctrico en gradientes de pH inmovilizados (IPGs) se selecciona en cadacaso para obtener la máxima resolución del grupo de proteínas de interés.

Separación en la 2ª Dimensión (SDS-PAGE): Una vez que las proteínas han sido separadas en función de sus propiedadeseléctricas, pasamos a separarlas en función de su tamaño o peso molecular mediante la electroforesis en geles de acrilamida en presencia de dodecil-sulfato sódico (SDS).
Estas dos separaciones sucesivaspermiten aislar prácticamente todas las proteínas de un proteoma en una matriz bidimensional (“electroforesis bidimensional”).

Tinción: Para visualizar las proteínas en el gel, éstas deben ser teñidasde alguna manera. La elección del método de tinción viene determinado por diferentes factores, como la sensibilidad deseada, rango lineal, facilidad de uso, precio y tipo de equipo de adquisición...
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