ELECTROFORESIS DE AGAROSA
Páginas: 5 (1132 palabras)
Publicado: 27 de noviembre de 2014
ELECTROFORESIS DE AGAROSA
La electroforesis es un proceso que se utiliza para separar macromoléculas en una solución, en agarosa permite separar moléculas de DNA, cuando éstas son sometidas a un campo eléctrico y atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. Hay dos fuerzas de acción opuesta que determinan la velocidad de la partícula:
Primero, la fuerza eléctrica atrae en DNA hacia elelectrodo y la intensidad de la atracción es directamente proporcional a la carga.
Segundo, la fuerza de rozamiento se opone a la migración y su intensidad depende del tamaño y la forma de la partícula.
El DNA está compuesto por cuatro nucleótidos que tienen carga negativa y peso molecular similar. Por lo tanto, la aceleración impuesta por la fuerza eléctrica es igual para cualquiermolécula de ácido nucleico. La diferencia en velocidad de migración estará dada por la forma y tamaño de la molécula de DNA. En el caso del DNA doble cadena, la forma es la misma para cualquier molécula, entonces las distintas moléculas tendrán una velocidad que sólo dependerá de su tamaño, es decir, de su longitud en pares de bases.
Preparación del gel agarosa al 1% (Ejemplo)
1.Preparación de geles de agarosa de diferentes concentraciones (%) para diferentes volúmenes como se muestra en la siguiente tabla (Ejemplo).
NOTA: Las concentraciones varían de acuerdo al volumen que se desea tener.
2. Preparación de un litro de TBE 10X, ejemplo:
3. Prepare la bandeja sellando los bordes por presión o con cinta adhesiva (esto depende del modelo de cámarautilizado) y póngale los peines.
4. Pese 2,5 gr. de agarosa.
5. Coloque la agarosa dentro de un envase de vidrio que contenga 250 mL de buffer TBE 0,5X y caliente en el microondas o en el baño de María hasta su completa disolución.
6. Cuando la solución de agarosa haya alcanzado una temperatura soportable por la mano, agregue 2,5 ul de bromuro de etidio* (Solución madre 10 mg.mL-1) o 25 uL de SYBR Green *1 (dilución final de la solución comercial es 1 en 10.000).
7. Mezcle bien, agitando el recipiente en forma circular, evitando que se formen burbujas en la solución.
8. Sirva la solución en la bandeja de corrida vertiendo la solución lentamente por uno de los extremos de la bandeja y retire las burbujas que queden sobre el área de corrida de las muestras con unapunta limpia.
9. Deje polimerizar la agarosa.
10. Para la corrida, llene el tanque de la cámara de electroforesis con buffer TBE 0,5X hasta cubrir el gel.
11. Conecte los electrodos de la cámara a la fuente de poder, gradúe el voltaje deseado y corra las muestras.
REPLICACIÓN
La replicación de ADN comienza en un punto específico en la molécula de ADN que se llama origen delsitio de replicación. Inicialmente la enzima helicasa desenrolla y separa una porción de la molécula de ADN, tras lo cual las secciones separadas de una sola cadena de la molécula del ADN se estabilizan de acuerdo a la integración de proteínas que solo pueden unirse a una cadena de ADN. El complejo enzimático de la polimerasa del ADN se une a la porción separada dela molécula e inicia elproceso de replicación. La polimerasa del ADN solo puede añadir nuevo nucleótidos de ADN a una cadena preexistente de nucleótidos. La replicación comienza cuando la enzima llamada primasa forma un cebador de ARN en el origen del sitio de replicación. La polimerasa de ADN es capaz a partir de ese momento de agregar nucleótidos de ADN al cebador de ARN y empezar así el proceso de construcción deuna nueva cadena complementaria de ADN. Más adelante, el cebador de ARN se elimina mediante digestión enzimática y es situado por una secuencia apropiada de nucleótidos de ADN. Debido a que las dos cadenas complementarias de ADN se orientan en direcciones opuestas y a que la polimerasa de ADN solo puede acomodar la replicación en una dirección, se emplean dos mecanismos distintos para...
La electroforesis es un proceso que se utiliza para separar macromoléculas en una solución, en agarosa permite separar moléculas de DNA, cuando éstas son sometidas a un campo eléctrico y atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta. Hay dos fuerzas de acción opuesta que determinan la velocidad de la partícula:
Primero, la fuerza eléctrica atrae en DNA hacia elelectrodo y la intensidad de la atracción es directamente proporcional a la carga.
Segundo, la fuerza de rozamiento se opone a la migración y su intensidad depende del tamaño y la forma de la partícula.
El DNA está compuesto por cuatro nucleótidos que tienen carga negativa y peso molecular similar. Por lo tanto, la aceleración impuesta por la fuerza eléctrica es igual para cualquiermolécula de ácido nucleico. La diferencia en velocidad de migración estará dada por la forma y tamaño de la molécula de DNA. En el caso del DNA doble cadena, la forma es la misma para cualquier molécula, entonces las distintas moléculas tendrán una velocidad que sólo dependerá de su tamaño, es decir, de su longitud en pares de bases.
Preparación del gel agarosa al 1% (Ejemplo)
1.Preparación de geles de agarosa de diferentes concentraciones (%) para diferentes volúmenes como se muestra en la siguiente tabla (Ejemplo).
NOTA: Las concentraciones varían de acuerdo al volumen que se desea tener.
2. Preparación de un litro de TBE 10X, ejemplo:
3. Prepare la bandeja sellando los bordes por presión o con cinta adhesiva (esto depende del modelo de cámarautilizado) y póngale los peines.
4. Pese 2,5 gr. de agarosa.
5. Coloque la agarosa dentro de un envase de vidrio que contenga 250 mL de buffer TBE 0,5X y caliente en el microondas o en el baño de María hasta su completa disolución.
6. Cuando la solución de agarosa haya alcanzado una temperatura soportable por la mano, agregue 2,5 ul de bromuro de etidio* (Solución madre 10 mg.mL-1) o 25 uL de SYBR Green *1 (dilución final de la solución comercial es 1 en 10.000).
7. Mezcle bien, agitando el recipiente en forma circular, evitando que se formen burbujas en la solución.
8. Sirva la solución en la bandeja de corrida vertiendo la solución lentamente por uno de los extremos de la bandeja y retire las burbujas que queden sobre el área de corrida de las muestras con unapunta limpia.
9. Deje polimerizar la agarosa.
10. Para la corrida, llene el tanque de la cámara de electroforesis con buffer TBE 0,5X hasta cubrir el gel.
11. Conecte los electrodos de la cámara a la fuente de poder, gradúe el voltaje deseado y corra las muestras.
REPLICACIÓN
La replicación de ADN comienza en un punto específico en la molécula de ADN que se llama origen delsitio de replicación. Inicialmente la enzima helicasa desenrolla y separa una porción de la molécula de ADN, tras lo cual las secciones separadas de una sola cadena de la molécula del ADN se estabilizan de acuerdo a la integración de proteínas que solo pueden unirse a una cadena de ADN. El complejo enzimático de la polimerasa del ADN se une a la porción separada dela molécula e inicia elproceso de replicación. La polimerasa del ADN solo puede añadir nuevo nucleótidos de ADN a una cadena preexistente de nucleótidos. La replicación comienza cuando la enzima llamada primasa forma un cebador de ARN en el origen del sitio de replicación. La polimerasa de ADN es capaz a partir de ese momento de agregar nucleótidos de ADN al cebador de ARN y empezar así el proceso de construcción deuna nueva cadena complementaria de ADN. Más adelante, el cebador de ARN se elimina mediante digestión enzimática y es situado por una secuencia apropiada de nucleótidos de ADN. Debido a que las dos cadenas complementarias de ADN se orientan en direcciones opuestas y a que la polimerasa de ADN solo puede acomodar la replicación en una dirección, se emplean dos mecanismos distintos para...
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